甲基化引物探针设计方法.docxVIP

本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。  首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用 /methprimer/ ，较为简单直观。  直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此网站也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word内标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。  关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： 引物长度一般在18-35mer。 G-C含量控制在40-60%左右。 避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 退火温度Tm控制在 58-60C左右。 如果是设计点突变引物，突变点应