一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制.docVIP

? 一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制 文章来源： 　　　　 2006-7-19 16:40:44 ? 一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制 生理学报 2002年第3期第54卷 中山医科大学生理学教研室；广州 510089　刘培庆；鲁伟；潘敬运* 关键词：丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1；蛋白激酶K；心肌细胞；肥大反应；血管紧张素Ⅱ；一氧化氮；精氨酸 　　摘要：本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮(NO)信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽(ANP)的表达作为心肌肥大反应的指标,以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平, 以免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达, 以RT-PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现: (1) L-精氨酸(L-Arg) 10、 100 μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16%及31%, L-Arg (100 μmol/L)还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 其作用可被NOS抑制剂L-NAME所抑制; (2) L-Arg (100 μmol/L)可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率, 而在L-Arg处理之前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率明显增加, 可取消L-Arg的抑制作用,甚至超过AngⅡ组; (3) L-Arg (100 μmol/L)明显增加MKP-1蛋白表达, 比对照组增加225%, NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达,分别抑制88%、 83%, 而AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 增强了L-Arg的作用。以上结果表明, NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG,促进MKP-1的表达, 从而增加MAPK去磷酸化实现的。心肌肥大是 高血压最常见的并发症之一, 它既是高血压时心脏负荷过大引起心肌组织代偿性生长的结果, 也是心脏的病理性重构过程。临床流行病学资料表明,高血压合并心肌肥厚时猝死、 心律失常、 心绞痛、 心力 衰竭等心血管疾病的发病率和死亡率明显增高, 严重影响高血压患者的预后,心肌肥大目前已被列为心血管疾病的独立危险因子［1, 2］。因此, 探讨心肌肥大的发生机制、 寻求合理的防治措施具有重要的理论及实践意义。 　　近年来的研究表明, 寻找信号传导通路的调控机制是揭示心肌肥大细胞分子机制的关键［3］。由于心肌细胞存在共同的分子效应信号,胞外多种刺激都可导致最终的心肌细胞肥大反应。现已明确, 压力超负荷及某些生长因子如血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、 α1受体激动剂、内皮素-1(endothelin 1, ET-1)及某些细胞因子是导致心肌肥大的重要因子［4］。 亦有资料提示， 某些扩张血管、抑制蛋白合成的因子可能具有抑制心肌肥大的作用［5］。本研究室近几年的研究揭示一氧化氮(nitric oxide, NO)对心肌肥大具有明显抑制作用,可抑制多种致心肌肥大因子如AngⅡ、 ET-1等介导的心肌肥大反应。我们最近的研究表明, NO前体L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)可抑制肾性高血压大鼠心肌肥厚,同时心肌组织的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)表达发生了重要的改变［6~8］。 为了进一步揭示L-Arg及NO抑制心肌肥大反应的机制,本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 以心肌细胞蛋白合成速率、 心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide, ANP)表达为心肌肥大反应的指标, 从细胞学及分子生物学角度研究NO信号系统在AngⅡ诱导心肌肥大反应中的作用及机制。 　　1材料和方法 　　1.1 试剂及仪器 TRIzol试剂盒购自Gibco公司; 兔抗鼠MKP-1单克隆抗体、 leupeptin、 apoprotinin、 PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为TTYADFIASGRRANA-IHD)均为Sigma公司产品; 化学发光增强剂(ECL)试剂盒(Phototope-HRP western Blot Detection Kit)为New England Biolab公司产品, 其它试剂均为国产分析纯。Revco超低温冰箱(美国); eppendorf 5417R型低温离心机