双向电泳技术和实验流程.pptVIP

* 4、固相pH梯度的优点和注意事项 3、固相pH梯度等电聚焦原理 蛋白质分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中迁移，知道达到自己的等电点，停止迁移。 固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的第一相，但固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH测定困难，只能计算。 注意事项：温度：20-30℃ ；电压：梯度上升。 * 加样方式 * 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH * 第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。可得到天然蛋白质的分子量。 * 连续电泳 不连续电泳 浓缩效应 凝胶层 缓冲液离子成分 pH 电位梯度 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 * 2、影响凝胶聚合的因素 形成凝胶试剂的纯度 凝胶浓度 温度和氧气的影响：23-25℃ 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点 * 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电