荧光定量PCR技术讲座：理论基础、引物及探针设计、内参选择、体系优化、实验方案、数据分析、污染防控.ppt

荧光定量PCR技术讲座 ------分子生物学实验技术系列讲座Ⅲ 郑州瑞德生物技术有限公司郑州瑞德基因技术研究中心 前言 现代生物科学完全是建立在实验技术上的一门学科，每一次技术的进 步都极大地提高了生物科学的理论水平。从显微镜的发明到细胞学说的诞 生，从孟德尔的豌豆实验到遗传学第一、第二定律的提出，从X射线衍射 技术对核酸结构的分析到DNA双螺旋结构模型的建立，从测序技术的进步 到人类基因组计划的完成......还没有哪一门学科的进步像生物学这样如 此依赖于实验技术的提升。 生命科学的进步完全依靠对生物体内微观生命现象的研究，这就要求 研究者在实验时必须严谨、精细，必须一丝不苟地注意实验中的每一个环 节，精细地操作每一步实验，一丝不苟的分析每次的实验结果，步步为 营，细节决定成败。 大纲 一、荧光定量PCR技术的基础理论 二、引物及常见荧光探针的设计 三、内参基因的选择 四、反应体系的优化 五、实验方案的选择 六、误差分析及操作规范 七、实验中污染的防控 八、SNP及稀有突变检测 九、实验结果的分析 一、荧光定量PCR技术的基础理论 1、荧光定量PCR技术概论 荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技 术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进 行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短 短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为 分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 1、荧光定量PCR技术概论 荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通 过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。 系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 2、荧光定量PCR常用的三个概念 扩增曲线、阈值、CT值 （1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式 一、荧光定量PCR技术的基础理论 2、荧光定量PCR常用的三个概念 （2）、阈值线 在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上， 所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 2、荧光定量PCR常用的三个概念 （3）、CT值 PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的 扩增循环数。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 3、荧光定量PCR的化学基础 荧光定量PCR是随着PCR循环的进行，以荧光信号强度的积 累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特 点： （1）、本底低 （2）、单位荧光强度高 （3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧 光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系 （4）、没有PCR产物时，没有荧光 （5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种 荧光不会产生荧光的交叉干扰 一、荧光定量PCR技术的基础理论 3、荧光定量PCR的化学基础 目前常用的几种荧光物质 （1）、Taqman探针类 一、荧光定量PCR技术的基础理论 3、荧光定量PCR的化学基础 Taqman常用的荧光基团和淬灭基团 荧光基团：5’端常用荧光基团FAM标记，最佳激发光波长：494-495nm，最大 发射光波长：518-520nm。 淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500— 560nm，最佳激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生的发射光 具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560—650nm，当做 多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已 不常用。 BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会 产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较 为常用，尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。 一、荧光定量PCR技术的基础理论 3、荧光定量PCR的化学基础 Taqman探针的特点及应用 （1）、特异性强、准确性高 本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异 性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCR产物 的量成正比关系，因此准确性极高。 （2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物