《高温纤维素分解菌分离纯化》【毕业设计论文】.docVIP

高温纤维素分解菌分离纯化 2 - 红河学院生命科学与技术学院生物系 04级生物科学 0 引言 发展现代农业，走生态农业之路，是实现社会主义新农村建设的必经之路，是发展农村生产力和实现农村经济快速健康发展的迫切需要。然而，目前农村的实际情况是以农作物秸杆为主的大部分天然纤维素一部分是自然腐烂，还有一部分是被农民焚烧。这不仅污染环境，而且造成了自然资源的极大浪费。因此，如何将纤维素物质降解转化为糖、乙醇、甲烷等容易利用的小分子有机物是当前国际上的重大课题之一。 目前,高温好氧堆肥化处理是解决农村固体废物问题的一个重要途径,具有保护环境,节约原材料和能源、投资少、运行费用低等优点[1] 。但是,农村固体废物,尤其是农作物秸秆中含有大量的木质纤维素,其成分复杂,难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用[2] 。因此,木质纤维素的生物降解成为生物技术处理有机固体废物的关键,也是近年来研究的重点。然而,在木质素、纤维素和半纤维素等分子产生破坏,断裂和分解的主要阶段——堆肥高温阶段,由于温度的影响,微生物种群受到很大的抑制,表现为种类单一,数量减少,比中温阶段要少1～2个数量级,这无疑限制了大分子难降解的木质纤维素物质的快速降解[3 ] 。已有的研究表明[4] ,在堆肥高温阶段,堆肥中绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被杀死,是保证堆肥无害化的最重要阶段。但同时堆体温度不宜过高,否则不仅抑制大部分微生物的生长和活性,并且会过度消耗有机质,降低堆肥产品质量。堆体温度应控制在45～65 ℃之间,尤其是在55～60 ℃时比较好,此时也是木质纤维素等大分子物质降解的最适温度[6],因此,研究该温度范围内的微生物活性及降解性能具有重要意义。 在高温纤维素分解菌的筛选及性状研究方面,国内外均有相关报道,种类从真菌,放线菌到细菌均有所涉及。Peter L. Bergquist 等[6]曾经列举总结过一系列的高温木质纤维素分解菌,他们大部分都是厌氧菌,其中只有3 种是好氧菌。韩如等[7] 利用纤维素降解细菌和纤维素粘附的方法分别从新鲜牛粪、高温堆肥和实验室保存的纤维素降解富集物中分离得到4 株嗜热厌氧纤维素降解细菌。分离菌株能利用纤维素滤纸、纤维素粉、WhatmanCFII、微晶纤维素、纤维素粉MN300 和未经处理的玉米秆芯、甘蔗渣、水稻秸秆等。林世平等[8] 在从温泉、油井等热源地区采集的大量样品中,经过反复的富集、筛选,获得了多株特殊的高温厌氧纤维素分解菌。这些菌株都能在50～70℃较好地生长,且具有明显高于中温菌的活力。张毅等[9]从贡嘎山热温泉及土壤堆肥中分离到四株嗜热厌氧纤维素分解细菌,能直接转化纤维素产生酒精。齐云等[10]从堆肥中分离出一株分解纤维素的高温耐碱菌株,该菌株在固体纤维素平板上,培养4d可产生明显的分解纤维素透明圈。除此以外还有一些其他相关报道[11～15] 。但以上研究的研究对象多偏重于厌氧高温纤维素分解菌,好氧高温纤维素分解菌涉及较少;研究内容多偏重于分类学方面以及菌株在厌氧发酵纤维素类物质方面的应用。近年来一些国内学者[16] 也曾经研究了一个复合产纤维素酶的体系,得到一组分解能力很强的混合体系并已经制成复合菌剂用于复混肥的生产,该方面的研究也正在逐步展开。 本研究通过从堆肥、温泉等中采集样品筛选分离,获得若干生长快,耐温性好,降解性能强的高温好氧菌株, 可以为农村纤维素固体废物高温好氧微生物菌处理提供一定的理论依据。 材料与方法 材料 从温泉（弥勒、腾冲）、碧色寨堆肥采集样品。 滤纸处理 滤纸用1%醋酸浸泡24h, 用碘液检验确定无淀粉后。再用2%NaHCO3洗至中性,晒干待用。 仪器及试剂 主要仪器: SW-CJ-IF洁净工作台（苏州泰安空气技术有限公司）、THz-031高精度恒温振荡摇（上海申能博采生物科技有限公司）、MJP-250型霉菌培养箱（上海精密实验设备有限公司）、电子天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）、RHB-KT/C加热磁力搅拌器、旋涡混匀器、AKUP- = 3 \* ROMAN III-20纯水器（台湾振大水处理器材（太仓）有限公司）。 1.3.2 试剂配制： 1)醋酸缓冲液(pH5.2)：取10.52g冰醋酸钠溶于450ml蒸馏水中，用冰醋酸将该溶液的DH值调至5.2(约用l2 mI)，用蒸馏水定容至500ml[17]。 2）DNS试剂 ：称取酒石酸钾钠91 g于500ml蒸馏水中，依次加人3、5一二硝基水杨酸3.5 g，NaOH 20 g，加热搅拌，使之溶解，再加人重蒸酚2． g，无水亚硫酸钠2 5 g，搅拌使之溶解，1000ml定容，贮于棕色瓶中，冰箱低温保藏1周后使用。 3) CMC溶液：称取10gCMC(羧甲基纤维素钠)溶于1000mL醋酸缓冲