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2. 选择合适的荧光染料 ★ 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 ★ 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 ★ 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 ★ 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 * FACSCalibur光路图 每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号 FL1: 515nm - 545nm * 2. 选择合适的荧光染料 ★ 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 ★ 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 ★ 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 ★ 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 * 2. 选择合适的荧光染料 ★ 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 ★ 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 ★ 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 ★ 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 * * 荧光光谱重叠与补偿 530/30 585/42 利用电子术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿” * 荧光补偿 补偿前 补偿后 * 2. 选择合适的荧光染料 ★ 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 ★ 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 ★ 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 ★ 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 * * 3.染色 体积 温度 孵育时间 对照 * 4. 数据收集和分析 1) 画图（直方图，散点图） 2) 调整仪器设置到合适的状态 3) 寻找目标细胞 4) 我们可以得到怎样的结果？ 它们意味着什么？ * 仪器设置调节 1. 用阴性细胞调整仪器PMT电压 2. 用单染色的细胞调节仪器补偿 二原则： * 同型对照（Isotype control） 例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE 那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC PE: 细胞加上Ab B PE 同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2. 同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异性结合水平。 * 数据分析 设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数 * 如何设定阴性与阳性的界限 * 直方图 * 散点图 * Thanks! * * * * The sample stream is injected into the center of the sheath steam in the optical cuvette and the particles are carried upward in a single file past the laser beam. This results in what is known as a laminar flow, where the sample stream is centered within the sheath, and it does not mix with the surrounding sheath fluid. The appropriate pressurization of the sheath and the sample are important for maintaining the laminar flow. The sample pressure is always slightly greater than the sheath pressure. The difference in pressure between the sample stream and sheath fluid stream can be used to vary the diameter of the sample stream. Increasing the sample pressure increases the core diameter and therefore the flow rate. A higher flow rate is generally used for measurements such as immunophenotyping. The data is les