腹主动脉瘤血管平滑肌细胞凋亡和自噬发生研究.PDFVIP

中国科技论文在线 腹主动脉瘤血管平滑肌细胞凋亡和自噬发生的研究 1 1 2 1 杜亚豪 ，田翠 ，郑月宏 ，李汇华 1 中国医学科学院 基础医学研究所 基础学院病理学系，北京（100005 ） 2 北京协和医学院血管外科，北京（100005 ） E-mail ：hhli1935@ 摘 要：目的探讨平滑肌细胞凋亡和自噬在腹主动脉瘤发病中的作用。方法 正常主动脉组 和腹主动脉瘤组进行 TUNEL 染色，计数平滑肌细胞凋亡的比例。免疫组织化学染色检测 LC3 的表达，在光镜下观察二者病理形态学的变化。提取正常主动脉和腹主动脉瘤病人的组 织RNA ，用RT-PCR 的方法，检测自噬相关基因的含量。结果 TUNEL 染色表明，病变组 血管平滑肌细胞凋亡比例明显高于正常组(P0.05)；腹主动脉瘤组自噬指标LC3 蛋白及相关 基因（如Beclin1 、Atg4b 、Bnip3 、VPS34 ）的mRNA 表达水平也明显高于正常主动脉组。 结论：平滑肌细胞凋亡和自噬与腹主动脉瘤的发病相关。 关键词：腹主动脉瘤；平滑肌细胞；凋亡；自噬 1. 引言 腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm,AAA)的发病过程复杂，有许多因素与其有关。 普遍的观点认为AAA是在环境、生物化学、遗传学等因素共同作用下，胶原等结构成分破 坏，在动脉粥样硬化、高血压、吸烟等促进因素作用下促发AAA形成。AAA组织结构病变 的特征为中层弹力蛋白胶原纤维破坏结构紊乱或异常增生，血管平滑肌细胞(vSMC)的降解 使中层变薄，以及淋巴细胞和巨噬细胞浸润等。细胞凋亡是指由基因控制的细胞自主的有序 的死亡，是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答 有序变化的死亡过程。自体吞噬作用特征是自噬体的聚集，在溶酶体酶的作用下，自噬体吞 入的细胞成分被降解，该过程具有清除受损细胞器及异常蛋白质的重要作用，遭受过度自体 消化的细胞便以非凋亡的形态学特征走向死亡。本研究通过检测正常人动脉与腹主动脉瘤组 织平滑肌细胞的凋亡情况，以及在基因和蛋白水平上检测二者中的细胞自噬情况，探讨平滑 肌细胞的凋亡和自噬在腹主动脉瘤发病中的机理。 2. 材料与方法 2.1 组织和试剂 10例AAA组织由北京协和医院血管外科医师术中获取后提供，6例正常主动脉取自健康 非正常死亡尸体(死亡时间10 min) 。在无菌、无RNA酶条件下，于平肾动脉下方约4 cm处 切取主动脉壁，迅速冻存在液氮中备用。Trizol购自美国Invitrogen公司，LC3抗体购自RD 公司。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司， RT-PCR试剂盒购自Qiangen公司。其余试剂均为国产分析纯。 2.2 组织凋亡染色 切取AAA和正常主动脉组织进行固定、包埋，制作石蜡切片,厚度4um 。染色用TUNEL 试剂盒(Roche)，脱蜡、水化组织切片后，在蛋白酶K溶液中25 ℃孵育30分钟，严格按照说明 书操作，DAB显色，苏木素复染。染色阳性物质呈棕黄色，位于细胞核内，呈散在分布。 光镜下随机计数6个视野，共约2000个细胞，并计算每个视野阳性细胞的百分数，比较二者 差异。 -1- 中国科技论文在线 2.3 免疫组织化学检测LC3 蛋白的表达 切片制作同TUNEL染色法，免疫组化试剂盒为中杉金桥的PV-9000二步法检测试剂，一 抗用兔抗人LC3抗体（RD公司，稀释度为1：1000）。脱蜡、水化组织切片后，用3%H2O2 孵育10分钟，后一抗室温孵育2小时后，严格按照说明书操作，DAB显色，苏木素复染，脱 水、透明、封片。显微镜下观察棕黄色染色为阳性。 2.4 RT-PCR 检测自噬相关基因mRNA 提取AAA和正常主动脉组织RNA ，经检测OD 260/280 比值在1.80-2.00之间，琼脂糖电 泳可见28S ，18S，5S条带