如何用LC-MS-MS,更快速建立生物样品分析方法？.pdfVIP

网络原创大赛参赛作品 如何利用LC-MS/MS ，更快更好的建立生物样品分析方法? 前言： 以前曾在实验室的 seminar 上，做过一次关于如何建立生物样品分析 方法的工作报告。时隔两年，恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛， 在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下，与大家交流、分享。 首先明确一下文中提到的“生物基质”，主要指的是血浆、血清、唾液、尿液 或者器官组织等。药物透过机体的各种生理屏障，进入到这些基质中，就是我们 所说的“生物样品” (Biosample) 。生物样品中的药物浓度极低，我们如何利用灵敏 度高的仪器如LC-MS/MS ，更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢？ 下面我主要从以下四个方面进行阐述： 一、色谱-质谱条件的确立 1、质谱条件的确立 当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时，我们就需要建立一个质 谱分析方法。虽然仪器的型号不尽相同，但原理却是一致的。我们在确定方法时， 主要考虑以下几个因素： （1）化合物的性质：包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa 值。 首先了解化合物的结构，我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为 稳定的碎片离子作为定量反应的子离子，也可以根据经验判断选用哪种 source 更为合适；根据化合物的极性大小，我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶 媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应；而清楚化合物的 pKa 值，有助于我们选择流动相的添加剂及其pH 值，从而提高质谱响应。 （2 ）流动相添加剂的选择：在液相-紫外检测中，我们使用的添加剂的种类 繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发 的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。但是在液质 分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类 就会受到极大的限制。在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙 酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐，见图1。三乙胺在紫外检测中，常作为扫 尾剂，但是在液质检测中是绝对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清除，残留 第 1 页 共 11 页 网络原创大赛参赛作品 及其严重，能够抑制离子的响应。一旦三乙胺用量增加，时间延长，那么慢慢地 质谱就不能灵敏的检测化合物了，所以这点大家要注意，尤其对于液质的初期使 用者。 图1 （3 ）质谱离子源源的选择：质谱出现早期，主要有电子轰击源（EI ）、化学 电离源（CI ）、电喷雾电离源（ESI ）和大气压化学电离源（APCI ）。但随着科学 技术的进步，源的发展也是日新月异。目前，用于定量的离子源主要是电喷雾电 离源（ESI ）和大气压化学电离源(APCI)，他们的使用范围如图2-1 所示。 图 2-1 第 2 页 共 11 页 网络原创大赛参赛作品 ESI 源是液相离子化，主要用于分析极性比较大的化合物及大分子化合物； 而APCI 源是气相离子化，主要用于分析极性较小的小分子化合物。具体区别如 图2-2. 图2-2 在掌握以上基本信息后，根据各个型号仪器的标准操作规程（SOP）进行操 作，对各个参数进行优化，从而确定质谱分析方法。 2 、色谱条件的建立 在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间的分离必须达到完全分离，即R》 1.5，如果进行定量，那R 最好≧2.0 ，这就给分析工作者提出了很高的要求—— 准确的配制流动相，调好流动相的pH 及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们 经常使用多反应监测（MRM/SRM ）对化合物进行定量，由于MRM 要求选择两 次离子，因此它具有很高的专属性，基于这点我们对多个化合物同