第三章基因工程载体受体.pptVIP

第三章 基因工程的载体和受体 （ChapterIII Vectors and Hosts for Gene Cloning）; 一、用于基因克隆的载体;携带外源DNA进入宿主细胞的工具 能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子 实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞;2.载体的功能（function of vector）;3.载体应具备的条件（characteristics of vector）;质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体 ;（二）质粒（plasmid）;（1）质粒的自主复制性;（2）质粒的不相容性（incompatibility）;质粒不相容的分子机制;（3）质粒的可转移性;（4）携带特殊的遗传标记;3.几种代表性质粒;最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11×106Dalton，控制质粒拷贝数及复制，抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的拷贝数可从1~2个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。 ;编码大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌，由Col因子编码。 Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1：分子量约为5×106Dalton，无接合作用，多拷贝； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80×106Dalton，与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有1~2个拷贝。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。;只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。 ;即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。 当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。 ;4.质粒的构建;删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段的装载量。 灭活某些质粒的编码基因。 加入易于识别的选择标记基因。 选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列---多克隆接头(Polylinker)。 加入特殊的基因表达调控元件。;（2）一个合格质粒的组成要素;5.质粒的分类;报告基因：载体上导入，证明载体已经转入宿主细胞中，将含有目的基因的宿主从其它细胞中区分出来，比如抗药性报告基因、LacZ、luciferase、GFP等;6.如何阅读质粒图谱;RBS：ribosome-binding site 原核RBS：SD sequence 真核RBS：Kozak sequence ;7.重要的大肠杆菌质粒载体;（2）pUC18/19;pUC18/19的正选择标记 lacZ’ 的显色原理;蓝白斑筛选： pUC18/19质粒上的LacZ基因包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子、编码α肽链的区段、一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。当菌体中含有带lacz‘的质粒后，质粒lacz’基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整