抗原表达和纯化.pptVIP

抗原蛋白的表达和纯化 一、抗原组生产流程 可溶蛋白具体生产步骤 1、接种80ul菌种至100ml抗性培养基中，37度培养过夜。 2、次日加入新鲜抗性培养基至600ml，培养1.5小时至活力最旺盛。 3、加入0.5mM的IPTG诱导3.5小时 4、收集菌体（66转/秒×15min),弃上清，加入PBST悬浮菌体，加入200ulMPMSF,100ul EDTA(his标签蛋白不加），冰浴下超声破碎细胞。 5、摇床4度孵育1小时。 6、高速离心，133转/秒×15min。取上清，加入600ul beads结合过夜。 7、收集beads（33转/秒、瞬时），洗涤液洗涤3次。加入300ul洗脱液，4℃振荡洗脱1小时，瞬时离心，取上清。再次加入300ul洗脱液，洗脱1小时，两次洗脱液合为一管。 8、将所得的上清取10ul加入10ulsample buffer 制样，SDS跑胶。 9、根据maker 的跑胶结果目测蛋白质量及浓度。 二、实验原理 基因的表达 亲和层析纯化可溶蛋白 包涵体的纯化原理 SDS－PAGE电泳的基本原理 三、基因的表达 在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导。 如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 。 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。原核生物的基因表达主要是负性调控，诱导物可用于去除阻遏作用。 公司构建的基因工程菌采用乳糖操纵子调控系统。 （一）乳糖操纵子(lac operon)的结构 （二）阻遏蛋白的负性调节 （三）CAP/CRP的正性调节 CAP (catabolite activator protein, 分解代谢物激活蛋白) 涉及到正性调节. CAP 又称为 CRP (cAMP receptor protein), lac operon高水平转录必需的一个激活蛋白。 葡萄糖抑制 cAMP的形成。葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时, cAMP浓度增高。 lacI-系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖分解代谢有关的酶得到持续表达。 lacI+系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，这三种酶得到表达。 乳糖操纵子受到两种调节：阻遏蛋白的负调节和CAP的正调节，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时, 即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖时,基因才能够转录。 （四）乳糖操纵子诱导物 由于乳糖虽可诱导酶的合成，但易被β-半乳糖苷酶催化降解，并且产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物诱导。乳糖操纵子的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖（IPTG)，还可以是巯基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。 IPTG为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,可与阻遏物结合促进基因的表达。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送，不被大肠杆菌所分解所以浓度并不改变 （五）影响蛋白表达的因素 IPTG浓度：0.1-1mM 0.5mM 诱导温度:28℃ 37℃ 诱导时间:3.5h 四、亲和层析纯化可溶性蛋白 目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽S-转移酶(GST) 融合蛋白和6X HIS Tag融合蛋白。 融合蛋白的优点有： (1)表达效率高； (2) 产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免细菌蛋白酶降解的最好措施； (3) 产生的蛋白质易于鉴定，纯化。 GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表达方便而且基 本不影响蛋白的活性 （一）亲和层析技术原理 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的蛋白的一类特殊层析技术。 （二）亲和层析法分类 通常两个分子间特异亲和力的形成有两种情况： （1）两个分子之间，其构形有如积木般的互补，因为范德华力的关系，产生特异亲和力 （2）两分子之间，因为某些基团间产生了二级键，造成了吸引力。 亲和层析法按亲和配基的亲和力大小可分为两类（1）特异性配基亲和层析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值为10-7～10-15。 （2）通用性配基亲和层析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等，KD值为10-4～10-6。 （三） GST fusion protein的纯化 ——特异性配基亲和层析法 利用了GST与GSH间酶与底物构象互补的特异性结合特性，将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。其结合力是范德华力，结合力弱且需较长的结合时间，但特异性高。 GST fusion p