生物化学剖析鉴定的方法.pptVIP

第三章生物化学分析鉴定方法2 －－蛋白质　 酪氨酸的?max＝275nm，?275=1.4x103; 苯丙氨酸的?max＝257nm，?257=2.0x102; 色氨酸的?max＝280nm，?280=5.6x103; 肽指纹图谱技术 核酸的分析鉴定方法 核酸的分析鉴定方法 （一）概念： ?质谱（ Mass Spectrometry, MS） 　　是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。 生物质谱技术 ????电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol（10-12甚至fmol（10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。 （二）分类 1、电喷雾质谱技术 ??? （Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS）????电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用（LC－MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。 2、基质辅助激光解吸附质谱技术 ????基质辅助激光解吸附质谱技术（MatriX AssistedLaser Desorption /Ionization,MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有—一对应关系。 ??? MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。 3、快原子轰击质谱技术 ????（Fast Atom Bomebard-ment Mass Spectrometry ,FABMS）。 4、同位素质谱 ??? （三）生物质谱应用 　　随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域，特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用，不仅为生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展。 　Ａ、应用于蛋白质： 1、蛋白质分子量的测定 ??? MALI－MS技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应用，特别是在蛋白质分析中的应用，至今已被分析的蛋白质已有数百种之多，不仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，还可直接用来测定蛋白质混合物的分子量，也能被用来测定经酶等降解后的混合物，以确定多肽的氨基酸序列。可以认为这是蛋白质分析领域的一项重大突破。 2、蛋白质组研究 ???蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽、蛋白质的质量测定外，还广泛地应用于肽指纹图谱测定以及氨基酸序列恻定等。 3、肽指纹图谱 ????（ PePtide Mass Fingerprinting,PMF）测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法，对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比较，从而判别所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。 　　对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的，它采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子，并对其进行碰撞诱导解高，通过推断肽片的断裂，即可导出肽序列 ?? 　 Ｂ、应用于核酸 　　常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行分析，而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。 　　ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强有力的方法，它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从3’或5’端进行部分