第六章外源基因表达2.pptVIP

常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。 报告基因一般是编码酶的基因 哺乳动物细胞基因工程中：氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）、 β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）等。 植物基因工程中：GUS基因、CAT基因、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因）、荧光素酶基因和抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。 原理： 转化的外源基因正常表达时，转基因细胞中含有一定量的目的蛋白。从细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位印迹到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。 由于空气中的氧能够抑制丙烯酰胺单体的聚合，所以凝胶的制备是向封闭的双玻璃板夹层中灌胶完成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳通常采用垂直的方式。 层析的基本原理： 所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。 柱层析纯化蛋白质的步骤： 装柱 柱平衡 上样 洗脱 分部收集 检测 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换 离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 5、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 适用于分离低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及DNA序列分析。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的。通常是丙烯酰胺单体在过硫酸氨（AP）的引发和N,N, N′, N′-四甲基乙二胺（TEMED）的增速下，产生聚合反应，形成长链。又在N,N′-甲叉双丙烯酰胺的作用下，聚丙烯酰胺长链发生交叉连接而形成凝胶。聚合链的长度和交叉连接的程度决定了凝胶网孔的大小。 缺点：和琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳的整个过程显得有些繁琐。 优点： 分辨率极高，可分开长度仅相差0.1％的DNA分子，即1000bp中相差1bp； 其装载量远大于琼脂糖凝胶，多达10μg的DNA可加样于聚丙烯酰胺凝胶中的一个标准加样孔（1cm×1cm），而其分辨率不会受到显著影响。 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可用于要求最高的实验，如鼠胚显微注射。 PAGE Native：主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化。 SDS：主要用于变性的表达蛋白的分离与纯化。 在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳泳动率主要取决于蛋白质分子质量的大小，而蛋白质分子的荷电状态可以不考虑。 CHO-K1细胞 CHO-K1细胞——中国仓鼠卵巢的上皮细胞。 目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr－）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10μg/ml以上。 二氢叶酸还原酶可降解氨甲蝶呤 氨甲蝶呤可抑制DNA和RNA的合成。 ①外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持； ②适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达； ③对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养； ④细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。 该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。 CHO-K1 细胞特点 COS细胞 它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达SV40的大T抗原。 COS细胞的特点： ①细胞来源丰富； ②细胞易于培养和转染； ③能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增； ④能瞬时大量表达外源基因的产物。 由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。 利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。 鼠骨髓瘤细胞 鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA