第三章DNA重组基本操作.ppt

植物总DNA提取 1.植物总DNA提取原理及方法概述 （1）CTAB法 原理：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（ 0.3mol/L NaCl ）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀， CTAB能溶于乙醇。 4.将上清转入另一离心管中，假如1/10体积的10% CTAB，混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温下12000rpm离心10-20分钟。 5.取上相，重复4操作一次。 6.将上相转入新的离心管，加入1-1.5倍体积的1x CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温下放置30分钟，沉淀。 7.3500-4000rpm离心5-10分钟，去上清 ，沉淀吹干。 8.按0.5ml/g材料的比例加入1mol/L乙酸铵溶液，使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L乙酸铵至终浓度为2.5mol/L. 9.加入2倍体积的异戊醇，混匀，室温下放置10分钟。 10. 10000rpm离心5分钟，去上清。 11.用70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于适量TE。 优点： 能很好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材 料可优先采用。 （2）SDS法 原理： 利用高浓度的SDS，在较高温度（55-65 ℃ ）条 件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出 核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白 质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5mol/L 的KAC于 冰上保温，低温条件下KAC 与蛋白质及多糖结合成不 溶物），离心除去沉淀后，上清中的DNA反复用酚/氯 仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。 （3）植物总DNA提取时常遇到的问题 1.植物材料中含有较多的多酚类物质，使DNA呈褐色。 解决办法：提高CTAB提取缓冲液中巯基乙醇的含量 或在SDS提取液中加入6%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。 2.植物细胞壁难以破碎。 解决办法：在SDS提取液中加入蛋白酶K，在液氮冷 冻条件下研磨。 植物DNA样品纯度及浓度的鉴定 用于Southern杂交的植物DNA样品在纯度、长度及浓度上均有较高的要求。纯度上应无蛋白质、RNA、多糖及抑制限制性内切酶活性的物质；在长度上不应低于50kb；浓度应在0.5-1 μg/ μl之间。目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测。 （1）琼脂糖凝胶电泳 1.所提植物DNA应呈现出一条分子量较大的清晰条带。如样品呈弥散状，说明DNA已严重降解，可能原因是：所用的器皿及试剂是否灭菌；材料收集后是否立即冷冻，研碎过程中或研碎后进入提取液前是否融化；是否有剧烈振动、吸管口过窄、产生起泡、反复吹打等操作。 2.如在溴酚兰处出现明亮的荧光区，说明RNA过多，可用RNA酶消化。 3.如在样品槽内有荧光出现，说明DNA未完全溶解或浓度过高，或样品不纯。 4.估算样品的浓度。 （２）紫外分光光度法测定 1.纯度： 纯净的DNA溶液其OD260／OD280应为1.8， OD260／OD230应大于2.0。 如果OD260／OD280大于1.8，表明应中含有较多的RNA；如果OD260／OD280小于1.6，则说明样品中蛋白质较多； OD260／OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的小分子及盐类杂质，可增加70%乙醇洗涤沉淀的次数。 2.浓度： DNA样品浓度（ μg/ μl ）= OD260×稀释倍数×0.05 mRNA isolation Only about 3% of total RNA is specific message (mRNA). Most is 28S and 18S eg in 5mg of tissue about 10ug of RNA is present of which 0.3 ug is mRNA, a rare message accounts for 10fg-10pg in total, and a moderately abundant message 300pg How can we isolate such small amounts of message? mRNA isolation We utilise the feature of mRNA, ie the poly A tail Using a column containing a synthetic oligonucleotide oligo(dT) attached hybridise the mRNA to the oligo