《PCR及其衍生技术》.pptVIP

如何提高PCR扩增的特异性？ 升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会； 降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发； 改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性。 引物设计的特异性； 减少循环次数； 热启动（Hot Start）。即首先将模板变性，然后在较高温度时加入Taq DNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增更特异； 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高扩增的特异性。 PCR技术的主要类型 （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)： （2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)： （ 3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)： （ 4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)： （5）巢式PCR技术(NEST-PCR)： （6）多重PCR技术(multiplex PCR)： （7）重组PCR技术： （8）原位PCR技术： （9）荧光定量实时PCR技术ＰＣＲ 技术 （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)： 反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。 一种在已知序列中无 切点的限制性内切酶消化基因组DNA。 酶切片段自身环化。 以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。 扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段 。 cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE） 通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5和3端，包括单边PCR和锚定PCR。 1.基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及ORF保守区RT-PCR克隆； 2. 3’-RACE 3. 5’-RACE 1.基于蛋白质保守性的兼并引物的设计及ORF保守区RT-PCR克隆； 利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 对所找到的序列进行多序列对。 确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。利用软件设计引物 R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T 密码子的兼并性 氨基酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　密码子数 Ｍ、Ｗ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｙ　　　　　　　　　　２ Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ　　　　　　　　　　　　　　　　　　４ Ｌ、Ｒ、Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６ RT-PCR及定量RT-PCR （1）RT-PCR（reverse transcription-PCR） 原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。 是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。 PCR技术的主要类型 常用的两种逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus）： 酶活性最适温度42℃ MMLV（Moloney murine leukemia virus）：酶活性最适温度37℃ （2）定量RT-PCR（qRT-PCR）： 利用RT-PCR对mRNA水平进行半定量或绝对定量分析。 半定量RT-PCR 选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因mRNA作为内源性基因模板标准。 管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同进行逆转录，在各自的引物引导下扩增。 计算出扩增后目的基因扩增子/管家基因扩增子的比值，从而达到半定量的目的。 实时荧光定量PCR 常规定量PCR技术： —对PCR扩增反应的终产物进行定量 —重复性差 —半定量 实时定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一