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-- ---- 题 目： PCR 技术 姓名：余 昊 班 级：生物工程 1201 班 学 号：指导老师：刘继恺 摘要： PCR 是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。 关键词： PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 PCR技术 一、概念 ： 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增 DNA 序列的 技术。它与分子克隆和 DNA 序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作 的基础。在这三种技术中， PCR 方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。 PCR 技术使对微量的核酸（ DNA 或 RNA ）操作变得简单易行，同时还可以使核 酸研究脱离活体生物。 PCR 技术的发明是分子生物学的一项革命， 它极大地推动 了分子生物学以及生物技术产业的发展。 二、基本原理 （一） PCR技术的基本原理： 该技术是在 模板 DNA 、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，借助一小段双链 DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链 DNA 模板中的一 段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下， DNA 聚合酶将脱氧 单核苷酸加到引物 3′-OH 末端，并以此为起始点， 沿模板 5′→3′方向延伸，合成 一条新的 DNA 互补链。 PCR 反应的基本成分包括：模板 DNA( 待扩增 DNA) 、引物、 4 种脱氧核苷酸 (dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的 缓冲液 。类似于 DNA 的天然复制过程，其特异 性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 --退火 --延伸三个基本 反应步骤构成：①模板 DNA 的高温变性：模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时 间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板 DNA 与引物的低温退火 (复性 )： 模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的 互补序列配对结合；③引物的适温延伸： DNA 模板 --引物结合物在 TaqDNA 聚 合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与 半保留复制 原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性 -退火 -延 伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。 （二） PCR的反应动力学： PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y＝ (1＋X)n 计算。 Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数， X 表示 平 (Y)均每次的扩增效率， n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但 在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指 数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累， 被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加， 而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、 PCR 扩增 效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。 大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。 （三） PCR扩增产物： 可分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定在两 个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。 短产物片段和长产物片段是由于引 物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3端开始延伸，其 5端是固定的， 3端则 没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除 与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即“长产物片段” )结合。引物在与新链 结合时，由于新链模板的 5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3端被固 定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、 形成长短一 致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物 片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要 再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。 （四）标准的 PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物各 200umol/L 引物各 10～ 100pmol 模板 DNA0.1 ～2ug TaqDNA 聚合酶 2.