第9章目的基因的 获取.pptVIP

对已知序列目的基因的筛选 DNA探针筛选：构建的cDNA文库，每个噬菌斑或菌落中含有一个被克隆的cDNA片段。然后，利用原位DNA探针进行筛选目的基因。 PCR法筛选 （6）从cDNA文库中筛选目的基因 * 第九章 目的基因的获取 　 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。 目的基因： 人们所需要研究的基因。 目的基因 目的基因 需要克隆的DNA片段 建立高效表达系统 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系 确定其表达调控机制和生物学功能 目的基因的克隆与基因文库的构建 A PCR法 B 基因文库的构建法 C 化学合成法 1、概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2、原理： DNA复制 1、利用PCR技术扩增目的基因 DNA扩增仪 四种脱氧核苷酸 一对引物： 耐热的DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA( 需含有目的基因 ) 3、条件： 一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补。 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物 4、前提： 能量 5、过程 高温变性（解旋为单链） 低温退火（引物与单链互补结合） 适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链） 重复循环 预变性（增加DNA变性的概率） 引物 脱氧核苷酸 5、具体过程 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 、 _______________、___________ 、 ___________.等 ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 模板DNA（含目的基因） ATP ⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建） 根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 2、基因文库的构建及目的基因的筛选 基因文库构建的基本战略 构建基因组文库，材料来自染色体DNA 构建cDNA文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库。 基因组文库的构建 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 鸟枪法克隆目的基因 1. 目的基因组DNA片断的制备 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。 当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，采用合适这超声处理强度和时间，可以将切割的DNA片段控制在一定在大小范围内，其上限是载体的最大装载量，下限应至少大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。 一般来说，原核生物的基因长度大都在2kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达100kb以上，因而将外源基因片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的