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選殖及分析擬似人類G蛋白結合接受體基因的功能 Cloning and Characterization of A Human Putative G Protein-Coupled Receptor Gene 學 生 : 簡佳怡 (Chia-Yi Chien) 國立陽明大學 生命科學系 學士論文 National Yang-Ming University Department of Life Science Bachelor Thesis 中華民國八十九年五月 May, 2000 ABSTRACT 在整個人類基因體的研究過程中，如何鑑定新的人類基因及分析其功能是其中重要的一環。利用基因庫的資料，我們首先鑑定出一個未曾被發現的人類基因-BB29 DNA序列。透過選殖的步驟整個BB29基因的coding region 已經被選殖出來。BB29的基因大小共含有1125個核甘酸，能夠合成375個amino acids，其amino acid sequence裡含有七個hydrophobic regions，在結構上類似seven transmembrane domain protein，因此極可能是個新的G-protein coupled receptor。此外，我們也發現BB29之amino acid sequence與多種其他生物存在的基因序列之間具有高度的相似性，顯示這些基因在演化的過程中被完整的保留下來，它們在細胞功能上可能都扮演重要的角色。我們著手研究BB29 基因的生化及分子生物學特性，目前從human tissue blotting的結果，顯示BB29的表現並沒有組織專一性。由表現的一條約2.4 kb專一的 transcript判斷BB29在人類細胞中應為單一的基因。利用間接免疫螢光法我們發現BB29 protein的表現位於細胞膜上。另一方面利用酵母菌Saccharomyces cerevisiae 當作一個研究模式，藉由研究酵母菌細胞內與BB29序列相似的兩個基因，來幫助我們瞭解BB29的功能。實驗初步的結果，將這兩個酵母菌基因破壞後，顯示這兩個基因為nonessential gene，並且突變的細胞在平常的生長狀況下，細胞的形態、生長速度並沒有明顯的改變，此外在不同的碳源環境下，包括glycerol、oleate和raffinose，突變的細胞也依然可以存活，比較正常細胞和突變細胞的形態也沒有顯著的差別，表示這兩個基因產物在細胞利用這些碳源的能力中，並非必需的。最後我們也證明雖然這兩個酵母菌基因產物具有類似mating factor receptor的構造，但它們並不直接參與細胞交配的機制。 INTRODUCTION 人類基因體計劃將於最近完成，屆時人類所擁有的30億個遺傳密碼將完全被定序出，估算人類約擁有14萬個基因，而其中功能已知的基因數目卻不及十分之一。因此如何探討剩下90%未知功能之人類基因所可能具有的生物活性，乃成為二十一世紀生物醫學研究中最大的挑戰 ADDIN ENRfu (1)。 其中一個研究的途徑是以和現有人類基因庫做比對的方法，來鑑定及分析人類未知基因的特性及功能。我們實驗室從人類肝癌細胞的phagemid cDNA library 中任意挑了1000 個cDNA clones，經初步定序之後，將這些cDNA的部分序列，個別與human expressed sequence tags (ESTs) database做比對，先將一些部分序列重疊的clones，利用電腦軟體 (sequencher) 加以分析，因此得到一些可能含有open reading frames (ORFs) 的DNA序列片段，再將這些序列和NCBI的non-redundant GeneBank 比對，在所得到的結果中刪除一些已知基因的clones，留下可能是novel的部分，最後分別利用microarray的方法，分析這些基因在normal cell 與cancer cell 中的表現程度有無差異，由此得到的positive clones再進行完整的序列分析。在我們的初步選殖中發現有一個novel clone，我們稱之為BB29 (Fig.1) 。 雖然BB29 在microarray的結果，顯示此基因在normal cell與cancer cell 的表現量並無顯著的差異，但是利用BB29序列搜尋資料庫，發現BB29在mouse， Caenorhabditis elegans, Schizosaccharomyces pombe和Saccharomyces cerevisiae 等四種生物之基因組中存在具有高度相似性的基因 (Fig.2) ，另外