RT-PCR原理及应用方法.pptVIP

RT-PCR原理及方法 09-10-15 背景 基因的表达 基因组DNA (genomic DNA) 信使RNA (messenger RNA, mRNA) 蛋白质产物 不同细胞或组织表达不同的基因 目的 通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。 原理及方法 mRNA (messenger RNA) cDNA (complementary DNA) PCR产物 RT(反转录) PCR (聚合酶链反应) 原理及方法 步骤1--提取总RNA TRIzol法抽提总RNA 1、细胞1×107 或组织100mg,加1mlTRIzol (细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管） 颠倒混匀10下，室温5分钟。 2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。 3、4℃，离心12000g，15分钟。 4、转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。 5、4℃，离心12000g，10分钟。 6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。 7、4℃离心7500g，5分钟。 8、弃上清，空