DNA的重组与转座培训教材.pptVIP

星号活性：限制性内切酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性降低，即可以把原来识别的特定的DNA序列不同的碱基切断。 星号活性出现的频率、根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都有星号活性。 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a. DNA的粘性末端; b. DNA的平末端; c. 化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（Vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 载体（Vector） 理想载体的基本条件： 可转移性; 合适的复制位点; 多克隆位点：广泛、特异; 选择标志，便于筛选和鉴定; 分子较小，可容纳较大的外源DNA。 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 重组DNA的主要载体 质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份，绝大多数质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。 质粒载体特点 1、至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 遗传标记基因 标记基因的作用: 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞; 　 这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 　 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 RecA有两个主要功能： ①诱发SOS反应； ②促进DNA单链与同源双链发生链交换，使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以进行。 当Rec A与 DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上形成螺旋状纤丝。 Ruv AB复合物结合在Holldiay中间体 Ruv蛋白 由于DNA分子是螺旋结构，在持续进行链交换时要发生分子旋转。Ruv A和 Ruv B蛋白共同构成了DNA解旋酶。 RuvA四聚体有平面对称的四方形结构，能识别 Holliday中间体的交叉点，RuvB利用其ATP酶的水解活性而驱动DNA解螺旋和分支移动，在移动的后方又重新形成螺旋。 RuvC蛋白 RuvC蛋白是一种核酸内切酶，同源重组最后由 RuvC将 Holliday联结体切开，并由 DNApol和 DNA连接酶修复合成。 RuvC特异识别Holliday联结体并将其切开，它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定重组结果是片段重组体还是拼接重组体，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。 Holliday模型缺陷： 重组的两个DNA在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。 但一般单链断裂经常发生，两个分子在同位置发生断裂几率有限。 Moselson认为同源分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一分子同源区，造成链置换。侵入链留下的缺口由聚合酶补上，被替代的链被降解，它的残留末端与最初断链连接，形成中间体。 更多研究表明，重组由双链断裂启动，两同源分子之一发生双链断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具3’末端单链，它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应链则被置换，与原断裂链配对。 经修复合成、链的再连接，形成两个交叉，而非单链交换的一个交叉。 只有当两条DNA有75 bp以上同源区时，才发生同源重组，小于此值，重组率显著降低 同源性并不意味序列完全相同。两DNA只要含有一段碱基序列类似的同源区，就可发生重组。 现在认为， DNA双链断裂才能与同源分子发生链交换，将同源染色体分配到子代细胞，同源重组是减数分裂的原因，而非结果。 因此双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。 相当于原核中与重组有关酶的对应物在真核中也已发现。 酿酒酵母的rad 51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者功能相关。 该基因的突变造成双链断裂积累，且无法形成正常的联合复合物，但此蛋白不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核与真核的同源重组机制可能不同。 特异位点重组 广泛存在于各类细胞，有关主要过程： 某些基因表达的调节； 发育过程中程序性DNA重排； 有些病毒和质粒复制中发生的整合与切除。 特点： 1）一般发生在特定短