DNA高级结构、理化性质与应用2.pptVIP

(二) 在DNA解链过程中，由于更多的共轭双键得以暴露，DNA在紫外区260nm处的吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，这种关系称为DNA的增色效应。 (三) 四、核酸分子杂交的应用 1、RNA酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay, RPA) RPA是以液相杂交为基础发展起来的，可用于基因和mRNA的结构分析以及mRNA的定量研究。 其原理为：在体外经转录合成一个带有标记的单链RNA探针，此探针与待测RNA在序列上互补，二者杂交后，用RNA酶处理，未形成双链的RNA单链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链RNA受到保护，不被降解，然后通过电泳进行RNA-RNA杂交体的检测。 RPA的检测方法十分灵敏，结果可靠，是进行mRNA定量、mRNA末端定位以及确定内含子位置的常用方法。 总RNA 标记探针 杂交 RNA酶 水解 灭活RNA酶 沉淀RNA PAGE电泳 膜转移 与生物素探针杂交 洗膜、封闭 膜与抗生物素蛋白-碱性磷酸酶一起孵育 加入发光剂 X光片曝光 RNA酶保护分析示意图： 2、滤膜杂交： 滤膜杂交是固相杂交的一种，是将待测核酸分子结合到不同的滤膜上，然后同存在于液相中的标记探针进行杂交。 待测核酸样品可以直接点在滤膜上（称为斑点杂交）；也可以先将核酸样品经琼脂糖凝胶电泳分离，再通过印迹技术将核酸从凝胶中按原来的位置和顺序转移到滤膜上。这样可以比较准确地保持待测核酸片段在电泳图谱中的位置，同时又可以进行分子量测定。 这一技术通常用于DNA的限制性内切酶图谱分析、判断DNA的限制性内切酶片段长度多态性以及DNA的定性、定量等研究。 3、原位杂交(in situ hybridization)： 原位杂交是用标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交.这一方法可以保持组织或细胞的完整结构,因此可以精确地进行DNA或RNA在组织或细胞内的定位.此外,结合共聚焦显微镜的应用,这一方法还可以将特异的基因或DNA片段经荧光标记后在染色体上进行定位(fluorescence in situ hybridization, FISH). 4、DNA芯片(DNA chips)： DNA芯片技术是近年来发展起来的一项融合分子生物学与微电子等多学科的高新技术. 其基本原理类似于原位杂交. 在特定的固相支持物表面(常用计算机硅芯片)原位合成寡核苷酸,或者将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有顺序地固化于支持物表面 经荧光、生物素或放射性核素标记的核酸样品与之杂交 具有与芯片DNA序列互补的核酸样品即可与芯片上的探针结合 通过对杂交信号的检测分析，便可以得到样品的遗传信息（基因序列、基因表达等） 固定于芯片的探针可以是合成的寡核苷酸、克隆的DNA片段、PCR产物、单链的DNA片段或RNA片段. 待测的样品可以是DNA，也可以是mRNA. 由于DNA芯片可以容纳大量的探针，可以对样品进行平行、快速、高效、敏感的检测，因此其成为分子生物学研究的重要手段。同时，在临床医学和药物研究与开发方面得到了广泛的应用。 知识回顾Knowledge Review 一、DNA的双螺旋结构及其意义 1953年，Watson和Crick发现了DNA双螺旋（double helix)结构模型。 DNA双螺旋结构要点： (Watson和Crick，1953) DNA 由两条反相平行的脱氧核苷酸链组成，脱氧核糖-磷酸骨架位于双链的外侧，碱基位于内侧，双链的碱基之间以氢键相结合。 （碱基互补配对形式：A?T； G?C) 2. DNA是右手螺旋结构，螺旋直径为2nm，螺距为3.4nm。碱基平面垂直螺旋轴，相邻碱基平面距离为0.34nm，螺旋一圈包含10对碱基。 3. 氢键维持DNA双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。 图1-8 DNA双螺旋结构示意图 上述Watson和Crick的DNA双螺旋结构称为B型结构，是DNA分子在生理条件下最稳定的结构，如果改变溶液的离子强度或相对湿度，DNA螺旋结构的上述特征就会发生变化。 右手螺旋， 11 碱基/螺旋 右手螺旋， 10 碱基/螺旋 左手螺旋， 12 碱基/螺旋 可能参与基因的表达和调控 DNA双螺旋结构不同构型的意义并不在于其螺旋直径及其高度的变化，关键是由于这些变化而引起的表面结构的改变，进而影响其生物学功能。 DNA双螺旋的这种表面结构有助于DNA结合蛋白识别并结合特定的DNA序列。而这种表面构型的变化对基因组DNA与其DNA 结合蛋白的特异性相互作用具有重要的意义。 二、其它类型的DNA高级结构 1、三股螺旋DNA 三股螺旋DNA也称三链DNA（triple strand DNA, tsDNA),