聚合酶链反应-实时荧光PCR.ppt

TaqMan Probes工作原理 探针与目标序列配对时 ，发生 FRET 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 扩增曲线 Real time PCR 的化学基础 参数 Rn: 一个反应管经 n次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+: 反应管含有模板DNA。 Rn-: 反应管不含有模板DNA。 理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn）超过本底,达到可检测水平时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 基线： baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未超出背景 Ct值极具重现性 在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 Threshold 104 103 102 随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系 TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等 结果具有高特异性与高敏感性 只适合于一个特定的目标 TaqMan MGB探针 荧光素 非荧光淬灭基团 与目标序列互补 MGB (Minor Groove Binder) 将探针的Tm值提高10℃ MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。 TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 分子信标(发夹型杂交探针) 荧光基团 茎由互补配对的序列组成 环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 分 子 信 标 工 作 原 理 探针杂交到DNA模板 光 发出荧光 荧光基团 DNA 模板 淬灭剂 茎 环 光 淬灭 * * * * * * * dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20-200μmol/L,浓度升高增加 非特异性扩增 脱氧核糖核苷酸（dNTP） * 从一种生活在热泉（80℃-90℃）中的水栖噬热菌中提取，有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用: 模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增） DNA聚合酶 * Taq DNA聚合酶复制的保真性： Taq DNA聚合酶无3’ → 5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。 Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶： Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2-10倍。 * 镁离子浓度反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。 镁离子浓度 * PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） * 1、温度 变性温度：94 -97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶 促活性 * 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5-7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒-1分钟，时间过长易导致非特异性扩增 * 3、循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但