第十章-园艺植物遗传转化1.ppt

第二节 园艺植物遗传转化方法 2.基本步骤及其应用 基本程序包括： 1）外源DNA的制备； 2）根据受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间及方法； 3）将外源DNA导入受体植物； 4）转基因植物目标性状的鉴定及分子检测。 利用花粉管通道法导入外源基因的方法通常为： 花粉粒与外源DNA混合授粉法、花粉粒培养法、柱头滴柱法、花粉粒转化法和微注射法等。 第二节 园艺植物遗传转化方法 3.优缺点 优点： 1）不依赖于细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等过程，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，成本低，适宜普及； 2）适用于多种单、双子叶植物 局限性： 1）该种方法只能在开花期才能进行，而且受体植物的受精过程及时间规律难以掌握； 2）重复性差、成株转化率相对低，以及外源DNA整合机制不清楚的问题依然存在 第二节 园艺植物遗传转化方法 （三）种子浸泡转化法 定义：浸泡转化法指将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、幼穗甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用可将外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。 第二节 园艺植物遗传转化方法 1.转化原理 浸泡转化是利用细胞自身的物质运转系统将外源DNA直接导入受体细胞。 将外源DNA吸入植物细胞的途径有： 1）通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统可以将外源DNA运输到每个细胞； 2）通过内吞作用将外源DNA摄入细胞内； 3）通过传递细胞的膜透性的改变为大分子物质透过细胞提供机会 第二节 园艺植物遗传转化方法 2.基本步骤及其应用 浸泡转化法的基本步骤： 1）外源DNA的制备； 2）具有生活能力种子的获得及浸泡处理； 3）在浸泡液中加入外源DNA； 4）种子培养、发芽及抗性鉴定。 第二节 园艺植物遗传转化方法 3.优缺点 优点：种子浸泡转化法是植物转基因技术中最简单、快捷、便宜的一种转化方法，不需要昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，并且容易推广普及； 局限性：在于转化率低，重复性差，而且筛选和检测也比较困难。 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 为了筛选和鉴定携带目的基因并稳定表达的转化植株，已发展处一系列的转化基因植物的筛选和鉴定的方法： 1）根据检测的基因功能分为： 调控基因（启动子和终止子）、选择表及基因检测、 目的基因直接检测法 2）根据检测的不同阶段分为： 整合水平检测、表达水平检测法 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 3）外源基因整合检测方法为： Southern杂交、PCR、PCR-Southern杂交、原位杂交、DNA分子标记技术等 4）表达水平的检测方法为： Nourthern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸收法（ELISA）、Western较等 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 一、利用选择标记基因和报告基因鉴定 定义： 选择标记基因是指在选择压下，编码产物能够使转化细胞、组织具有对抗生素或除草剂的抗性，而非转化细胞则不能在施用选择剂的条件下生长、发育和分化的基因。选用选择标记基因有利于在大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株。 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 植物基因工程中选择标记基因一般具有4个特征： 1）编码一种不存在于正常植物细胞中的产物，如酶和蛋白质； 2）基因较小，易构成嵌合基因； 3）能在转化体中得到充分的表达； 4）容易检测并能定量分析。 报告基因是指其编码产物在受体细胞、组织或器官中具有表达活性，能够被快速地测定的一类特殊用途的基因。 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 （一）抗生素抗性基因鉴定 园艺植物遗传转化上常用的抗生素抗性基因有新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）和潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）。 1）nptⅡ是卡那霉素抗性基因或氨基葡萄糖苷磷酸转移酶Ⅱ基因，是园艺植物转化中运用最广泛的选择标记基因，其编码产物对卡那霉素、庆大霉素的那个具有抗性。卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体蛋白质的合成，会导致植物细胞死亡。常用浓度为50～100μg/mL。 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 2）hpt基因的表达产物对潮霉素具有抗性，因而在培养基中筛选的抗生素是潮霉素，常用浓度为30～100 μg/mL NPTⅡ活性的检测通常采用点渍法和酶联免疫测定法。 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 （二）除草剂抗性基因鉴定 植物遗传转化中常使用的除草剂抗性基因有bar、aroA、als和PSbA，其中bar和als最为常用。 Bar是编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）基因，该酶能是除草剂Basta（有效成分PPT）失活，从而达到除草剂的目的。因此，在遗传转化筛选培养基中加入相应的选择剂Basta、PPT、或Bialaphos，即可筛选歘转基