实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法.pptVIP

Please be quiet, 上课了！！; 1、学习利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法； 2、掌握分光光度计的使用方法； 3、掌握标准曲线的绘制。 ; 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。 当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色. 蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收. 在一定范围内（ 10 -1000ug/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。;考马斯亮蓝G-250染色法原理;双缩脲反应： Folin-酚试剂法（Lowry法）： 紫外吸收法： 微量凯式定氮法：;（1）双缩脲法：;（2）Folin-酚试剂法（Lowry法）：;（3）紫外吸收法：;（4）微量凯式定氮法：; 1、 实验材料：豆芽 2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计 (2)研钵 (3)离心机 (4)试管 (5)容量瓶等 3、试剂： （1）染色液：考马斯亮蓝G-250 (100mg 考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%磷酸，加水稀释至 1L) （2）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。 ; 1、制作标准曲线： 取7支试管，依次分别加入0.0，0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm 值，绘制标准曲线。;制作标准曲线： ;标准蛋白质浓度;标准曲线的绘制; 称取豆芽叶片2g → 研钵中加2ml水→研成匀浆→转入离心管→用水分三次冲洗研钵，每次2ml→均转入同一离心管 →等重后4000转/分离心15分钟→取上清液转入25ml容量瓶→定容。; 吸取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250 染色剂5ml，充分混匀，放置5分钟，测OD595nm，记录结果，查曲线，得蛋白质浓度C0(mg/ml)。 ;分光光度技术 ; 朗伯—比尔(Lambert-bee)光吸收定律： A＝lg（I0/It) ＝ -lgT ＝ εb c （1）A—吸光度 “OD”：描述溶液对光的吸收程度； 同一种溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光度最大处所对应的波长称为最大光吸收处。 同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异，在最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度法进行物质定量分析的重要依据。 I0：表示入射光强度，It ：表示光线通过溶液后的强度。; ; 分光光度计的组成和构造： （1）光源； （2）单色器 （3）吸收池； （4）接收检测放大系统(检测器)； （5）信号指示系统(显示或记录器)。; ⑴ 光源： 用于可见光光源是钨灯和卤钨 ，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），适用波长范围是320～1100nm。 用于紫外光区的是氢灯和氘灯适用波长范围是195～400nm。;⑵ 单色器： 单色器是分光光度计的心脏部分。 把来自光源的混合光波分解为单一波长的光 能随意改变光的波长。 单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件:主要是棱镜和光栅;⑶吸收池 吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。 光学比色杯和石英比色杯两种。 光学比色杯适用波长范围是400nm～2000nm ，只能用于可见光。 石英比色杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm～3000nm。 光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml）; 比色杯使用注意事项： ① 比色杯在使用前后都要彻底的清洗。 ② 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。 ③ 严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 ④ 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 ;⑷ 检测器： 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等。 ;偏离朗伯—比耳定律的原因;（1）物理性因素;(2) 化学性因素;分光光度法在生化实验技术中的应用： 主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸含量的测定、酶活力测定、酶催化反应动力学的研究等。;五、结果计算：