酶活测定方法精编版.docVIP

……………………………………………………………最新资料推荐………………………………………………… PAGE PAGE 1 土壤酶活测定 取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。 蔗糖酶测定（比色法） 1. 方法选择及原理 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（葡萄糖和果糖）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量求出糖的含量。也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物进行比色测定。还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。 目前，我国常用的主要是硫代硫酸钠滴定法，它是测定土壤蔗糖酶活性的经典方法。3，5-二硝基水杨酸比色法重现性较好，且手续较简便，适于成批样品测定。 测定土壤蔗糖酶活性时，均以蔗糖为基质，蔗糖液浓度范围为5-20％。在酸性介质中，蔗糖酶活性最大。为保持该酶最适pH，多使用下列缓冲液：醋酸盐缓冲液（pH4.5-5.5），磷酸盐缓冲液（pH4.9-5.5），醋酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.5）。 2. 试剂配制 （1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。 （2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g Na2PO4?2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。 （3）8％蔗糖溶液。 （4）甲苯。 （5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中（5mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。 标准曲线绘制：取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml容量瓶中，与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色。 3. 试验步骤 称取5g风干土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8％蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲液和5滴（0.25ml）甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量量瓶中，加3ml 3，5-二硝基水杨酸，并在沸水的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质（无蔗糖）对照，整个试验需做无土壤对照。 4. 结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（毫克）＝a×50×ts/m a－显色液中葡萄糖浓度（mg/ml）， 50－显色液体积（ml）； ts－分取倍数（吸1ml滤液比色就是20/1）； m－烘干土质量（g）。 脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。大多数细菌、真菌和高等植物具有脲酶。它是一种酰胺酶，能酶促有机质分子中肽键的水解。土壤的脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤脲酶是一种酰胺酶，能促进土壤有机质分子中酰胺键的水解，因此，在富含有机质的土壤中，脲酶的活性一定高。脲酶是一种高度专性的酶，能酶促尿素的水解，因此可以测定产生的氨或二氧化碳的量，或测定基质尿素的减量，以表示脲酶的活性。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂：（所用试剂至少为分析纯，水最好用高纯水） 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）：184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水；147.5g氢氧化钾溶于500ml蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将pH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮