绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆原核表达及纯化.pdf

中国农业科学 2014,47(11):2162-2172 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.010 绿盲蝽超气门蛋白ALUSP 的克隆、原核表达及纯化 谭永安，肖留斌，孙 洋，赵 静，柏立新 （江苏省农业科学院植物保护研究所，南京210014 ） 摘要：【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP ），获得原核表达的重组蛋白，为ALUSP 的功能研究奠定 基础，也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP 基因序列设计简 并引物，获得ALUSP 的保守序列；再通过设计特异性引物，利用RACE 方法，分别克隆ALUSP 5′及3′段序列， 然后通过拼接获得ALUSP 全长序列；应用生物信息学方法，对ALUSP 基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分 析，建立系统进化树；将含有ALUSP 的T 载体经EcoR I及Xho I 双酶切，构建ALUSP 原核表达载体pEGX6P1-ALUSP， 将该表达载体分别在 15、25、30 和 37℃条件下进行诱导表达，再通过GST 琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得 ALUSP 功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP 开放阅读框长1 005 bp，编码334 个氨基酸，预测分子量56.63 kD，理论 等电点8.42；序列特征分析表明，该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征，由A/B 域（249 bp ）、C 域 （198 bp ）、D 域（69 bp ）和E 域（489 bp ）组成，其中C 域高度保守，包含2 个锌脂结构并含有 1 个P-盒和 1 个D-盒，且含有由8 个氨基酸构成的核定位信号，D 域含有1 个识别DNA 元件的T-盒，E 域含有1 个由8 个α螺 旋和1个β折叠形成袋状结构；氨基酸比对结果表明，ALUSP 的氨基酸序列与稻绿蝽USP 序列一致性最高（57.82% ）， 与其他昆虫的 USP 序列一致性较低，如膜翅目的 Melipona scutellaris （46.05% ）、Scaptotrigona depilis （45.94% ）；系统进化树分析结果显示，半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP 较为分化，位于不同分支，ALUSP 与稻绿蝽 USP 进化关系最近，可能来源于共同的祖先。EcoR I 和 Xho I 双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到 -1 pEGX-6P-1 载体上，命名为pEGX6P1-ALUSP；经37℃、1.0 mmol·L 的IPTG 诱导的pEGX6P1-ALUSP 重组质粒可特异 性表达 1 个约 65 kD 的蛋白，并且该重组ALUSP 蛋白主要以包涵体形式存在；收集含有目的基因的菌株进行GST 琼脂糖亲和层析和分子筛层析，最后进行复性和纯化后在65 kD 附近仅出现1 条清晰的特异性条带，表明已得到 纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP 全长，其具有昆虫超气门蛋白的典型特征，并获得了原核表达的重组蛋白。 关键词：绿盲蝽；超气门蛋白；基因克隆；原核表达 Cloning, Expression and Purification of Ultraspiracle Protein Gene from Apolygus lucorum TAN Yong-an, XIAO Liu-bin, SUN Yang, ZHAO Jing, BAI Li-xin (Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014 ) Abstract: 【Objective 】 The objectives of this study are to clone the ultr