基于TALE的靶向基因修饰技术-方金辉.pptxVIP

Precision genome engineering based on TALE 基于TALE的靶向基因修饰技术 ;报告纲要;报告纲要;我们研究一个生物的性状，最终都需要做一件事：改变基因，从必要性和充分性两方面阐明基因功能。 1）Loss function：降低基因或删除基因 Give function: 提高基因的表达 ;生物学家的梦想：随心所欲地操作基因 ;5;报告纲要;TALE蛋白中间含有一个重复区域，该区域由33-35个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守，但第12位和13位的两个氨基酸可变，称为重复单元可变的双氨基酸残基（RVD）。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基，有如下一一对应关系： NG = T, HD = C, NI = A, NN = G or A ，NH=G 。;Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670;2011年，把 C 端的转录激活子替换为 FokI 核酸内切酶，首次实现了 TALE 蛋白的人工改造，并显示具有良好的效果。;FokI核酸内切酶切割DNA无序列特异性，FokI通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能：;11;切割后（细胞 DNA 损伤后）会启动两种修复机制过程，一种为末端非同源依赖的修复机制 (NHEJ)，另一种是依赖同源重组的修复机制 (HDR)：;13;14;报告纲要;三、TALENs的操作要点;目前，已发展的TALEN组装方法： 基于Golden Gate（GG）克隆的方法： （1）基于PCR的GG法（GG-PCR） 通过 PCR 扩增 TALE 重复单元，用 IIS 型内切酶产生多种一一对应、特异匹配的粘性末端对。一次可以连接 4~6 个 TALE 重复单元。 （2）传统的基于质粒载体的GG法（GG-Vector） 基于质粒载体，用 IIS 型内切酶产生多种一一对应、特异匹配的粘性末端对。一次可以连接8~10 个 TALE 重复单元。 ;3. 基于连续克隆组装的方法： （1）限制性酶切－连接法（Restriction enzyme and ligation，REAL） 普通的限制性内切酶与IIS型核酸内切酶相结合的逐步连接策略。 （2）单元组装法（Unit assembly，UA） 用同尾酶切割产生相同的粘性末端，逐步连接不同的重复单元。 （3）和idTALE一步酶切次序连接法 从天然的TALE蛋白中提取出以一个RVD和两个 RVD 为单元的片段，用 普通的限制性内切酶与 IIS 型核酸内切酶相结合进行逐步连接。 ;19;FastTALETM连接TALEN;亚克??到植物表达载体上;报告纲要;四、TALENs的应用;Activators ;TALE蛋白新功能;与ZFN相比，优势： （1）TALEN结合DNA的方式更便于预测和设计； （2）TALEN的构建更加方便、快捷，甚至能够实现大规模、高通量组装； （3）TALEN的特异性比ZFN高，而毒性和脱靶（off-target）效应则比ZFN低。;报告纲要;五、未解决的问题;谢谢大家侧耳倾听！;Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated (Cas) systems