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?第三章 高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography (HPLC)一、高效液相色谱法的特点1. 高效液相色谱法概述?GCHPLC应用范围热稳定、低沸点的物质热不稳定、高沸点、离子型的物质热力学理论较成熟正在发展中分析成本低高分离能力与柱的类型有关较高2. 高效液相色谱与气相色谱的比较?经典液相色谱法高效液相色谱法粒径(μm)75-6003-50（常用5-10）柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间 (h)1-200.05-1.0色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效(块/m)2-50104-105样品用量(g)1-1010-6-10-23. 高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 4. 高效液相色谱法的特点高压高速高效高灵敏度5. 应用举例丹参Radix Salviae Miltiorrhizae丹参的HPLC指纹图谱二、高效液相色谱理论基础高效液相色谱中的速率方程H=A+B/u+CuA=2λdpB→0C=? 迁移的流动相的传质阻力 滞留的流动相的传质阻力高效液相色谱中的速率方程涡流扩散项 纵向扩散 流动相传质 滞留区传质 固定相内传质2. 对速率方程的讨论选用细颗粒填料可获高柱效流动相流速低，有利于达到高柱效选用黏度小的流动相有利于提高柱效温度的影响液膜厚度的影响3. 柱外效应由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽，例如进样系统、连接管路及检测器的死体积等。三、高效液相色谱仪1. 高效液相色谱仪流程高效液相色谱仪2. 高压输液系统 往复泵原理示意图 往复泵 梯度洗提梯度洗提 即程序控制流动相的组成，使在整个分离过程中，溶剂强度按照特定的变化规律增加。 优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。 缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。溶剂A溶剂B溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B高压泵A 高压泵B混合室混合室泵 梯度洗提流程低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框图应用举例3. 进样系统 六通进样阀结构示意图4. 分离系统——色谱柱 包括柱管与固定相两部分一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm凝胶色谱柱内径3～12mm微柱内径1-2mm，长1-5cm制备往内径较大，可达25mm 以上5．检测系统 紫外检测器示差折光检测器荧光检测器电导检测器 （1）紫外检测器固定波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器二极管阵列检测器固定波长的紫外检测器Z型流通池结构 可变波长的紫外检测器 二极管阵列检测器二极管阵列检测器之三维图二极管阵列检测器之Isoabsorbance Plot 响应特性选择性检测器，如芳烃类化合物的检测灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质线性范围宽，104-105对温度及流动相的改变不敏感适合梯度洗提HPLC常规检测器应用举例波长的选择 （2）示差折光检测器结构响应特性通用性检测器低灵敏度基线易受温度的影响不适合梯度洗提荧光检测器结构响应特性选择性检测器。如PAH，蛋白质高灵敏度，比紫外高约1000倍适合梯度洗提应用举例电导检测器结构响应特性选择性检测器，对离子型化合物有响应灵敏度高受温度的影响不能梯度洗提讨论：液相色谱检测器的选择葡萄糖产品的含量测定地下水中酚类化合物的分析矿泉水中无机阴离子的测定痕量氨基酸的分析去痛片中有效成分的分析链烷基磺酸盐的测定蛋白质的分子量测定?示差折光紫外荧光电导应用范围通用选择性高选择性选择性可否梯度淋洗不可可可不可线性范围104105103104最小检测量μgngpgng对温度敏感度敏感低低敏感溶剂使用情况无限制受限制受限制受限制（5）几种检测器特性比较 四、HPLC主要类型及其选择 化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法 1. 化学键合相色谱法（1）分离机理正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化合物。 分配机理：分配系数 x为溶质，M为溶剂 反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性和离子性化合物。应用最广泛反相键合相色谱法的疏溶剂机理： 溶质进入极性流动相后，排挤部分溶质分子，其疏水基团由于流动相的斥力推动而直接与非极性固定相上的烷基缔合，构成单分子吸附层，这种作用时可逆的。当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥力下降。（2）固定相 疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。常用固定相类型分离方式 应用特点C-18反相、离子对普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物C-8反相、离子对与C-18类似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，适合肽类和蛋白质苯基反相保留适中