糖化酶的固定化与在葡萄糖生产中的应用工艺设计.docVIP

广 州 大 学 实 验 报 告 实验名称：糖化酶的固定化及其在葡萄糖 生产中的应用工艺 学 院：生命科学学院 专业年级： 学 号： 姓 名： 组 员： 指导老师：王小兰、柯德森 摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与固定时间的关系。本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化60min时，固定化糖化酶的效率最好；固定化10min时，固定化酶的活力回收为3.47％，偶联率为48.10％，相对活力为7.23％；固定化20min时，固定化酶的活力回收为4.74％，偶联率为54.76％，相对活力为8.66％；固定化30min时，固定化酶的活力回收为4.71％，偶联率为53.42％，相对活力为8.82％；固定化40min时，固定化酶的活力回收为3.84％，偶联率为58.13％，相对活力为6.62％；固定化50min时，固定化酶的活力回收为4.04％，偶联率为60.59％，相对活力为6.67％； 固定化60min时，固定化酶的活力回收为6.34％，偶联率为70.00％，相对活力为9.06％。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。 关键词：固定化酶效率时间酶活力 1、前言： 糖化酶，又称 葡萄糖淀粉酶，糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性未端切开a-1.4键处，也能缓慢切开a-1.6。因此，它能很快的把 直链淀粉从非还原性未端依次切下葡萄单位，在遇到1.6键分割，先将a-1.6键分割，再将a-1.4键分割，从而使 支链淀粉水解成葡萄糖。糖化酶用于以 葡萄糖作 发酵培养基的各种抗生素、 有机酸、 氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。 酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。 酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法、化学结合法、包埋法。本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等。本实验采用:GF-201大孔强碱阴离子交换树脂，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简单，条件温和，酶活性中心和高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。其缺点是：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强度和pH影响较大。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。 2、材料与方法： 2.1材料 （1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6缓冲液)，无水乙醇，盐酸。硫代硫酸钠（0.05M），碘溶液（次碘酸钠，0.1M）。硫酸2M。 （2）酶液、固定化酶及固定化后的残留酶液。 2.2实验仪器 恒温水浴锅（可达99℃，5个），酸度计（3个），容量瓶，量筒，烧杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，锥形瓶，试管架，吸耳球，pH试纸，滤纸，离心机，离心管，分光光度计等。 2.3试剂 （1）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 （2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。 （3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液55mL与B液145m