人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化_鉴定.docVIP

华西医大学报 　1999;30(3)∶249～252　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 J　WCUMS 人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的 高效表达及产物纯化、鉴定 李兴德1　屠重棋2　彭红卫1　袁淑兰2　吴凤锷1 1.成都倍菲生物工程有限公司(成都610041);2.华西医科大学附属第一医院 　　内容摘要　用Hind 和EcoR 双酶酶切经改造的,(haFGF)基因,将该基因片段插入表达载体pkk22323,加IPTG诱导该质粒转化 的大肠杆菌JM109表达,haFGF,获得了电泳纯haFGFL样品。纯化过程中haFGF样品的比活性为ED504.6ng ml,理化及生物活性分析与天然haFGF。 3 High-levelExpressionofHumanAcidicFibroblastGrowthFactorinE.coliandItsPurification　LiXingde,Tu Chongqi,PengHongwei,YuanShulan,WuFeng’e. 3 ChengduPerfectionBiotechnologyInc.,Chengdu610041 　　Abstracts　Areconstructedhumanacidicfibroblastgrowthfactor(haFGF)cDNAwasclonedintotheexpres2 sionvectorpkk22323,andtheexpressioninEscherichiacoli.JM109wasinducedbyIPTGinduction;theexpressionleveloftherecombinanthaFGFwasabout80mg L.TheexpressedhaFGFwaspurifiedtoidentitybyheparinaffinitychromatographyandtherecoveryrateofhaFGFwas65%.ThespecificactivityofthepurifiedhaFGFwas.ThecharactersofrecombinanthaFGFwasidenticaltothatofnaturalone.ED504.6ng ml Keywords　　haFGF　　Cloningandexpression　　E.coli.　　Purification　　Identification 　　成纤维细胞生长因子(FGF)是一类对中胚层和神经外胚层来源的多种细胞具有营养和促分裂分化作用的多肽,主要有酸性(aFGF)和碱性(bFGF)两种。aFGF在中枢及外周神经系统疾病及各种创伤的快速修复等的治疗方面,具有重要的医学价值[1]。美国默克公司1986年完成了编码牛aFGF和人aFGF的基因结构分析,并进行了基因克隆与表达, [2] aFGF分离与纯化的研究。英国利物浦大学1990 cia公司;大肠杆菌JM109菌株由本公司保存;限制 性内切酶EcoR 、Hind 为协和友谊公司产品;3H2Tdr为Amersham公司产品;肝素2SepharoseCL26B为Pharmacia公司产品;DMEM 培养基、细胞培养板为GIBCO公司产品;Balb c3T3细胞,由华西医科大学肿瘤研究所提供;肝素、haFGF对照品,SIGMA公司产品;IPTG,华美生物 工程公司产品。1.2　方法 1.2.1　重组质粒的构建及鉴定　参照Maniatis的 年用温控型表达载体,构建了高水平表达的aFGF [3] 基因工程菌(50mgaFGF 1993年,我L发酵液)。国军事医学科学院曾报道人的aFGF(haFGF)基因在大肠杆菌中克隆和表达(5mgaFGF L发酵液)[4]。在本文中,我们构建的haFGF工程菌,其表达水平及生物活性指标均达到国际领先水平,将haFGF的基因工程表达研究提高到了一个新水平, 方法[5],质粒用碱变性法提取,超速离心纯化DNA。用Hind 和EcoR 双酶酶切PUC2haFGF质粒,电洗脱法回收切出的0.48kbDNA小片段。表达载 体质粒pkk22323经Hind 和EcoR 酶切后用碱性磷酸酯酶(CIP)进行脱512P的反应。将纯化好的haFGF基因小片断与经CIP处理的pkk22323大片 对haFGF的理论及应用研究具有重要的意义。 1　材料和方法 1.1　材料 段以2∶1摩尔数混合,进行粘性末端连接,连接物转化入CaCl2处理的大肠杆菌JM109菌株,涂板后37℃培养直至转化子出现。用快速抽提和多种酶切 经改造的PUC2aFGF质粒,中科院上海生物化学研究所袁惠东博士赠送;pkk22323,购于Pharma2 的方法鉴定阳性菌落,琼酯糖凝胶电泳观察DN