匍枝根霉纤维二糖合成酶胞内糖基供体的初探及结构功能研究一.pdf

匍枝根霉纤维二糖合成酶胞内糖基供体的 初探及结构功能研究一 1 1,2 ** 1 张莹莹 汤斌 堵国成 （1 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214122） （2 安徽工程大学生物与化学工程学院 芜湖 241000） 摘要 纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶，前期研究表明匍枝根霉Rhizopusstolonifer TP-02 具有纤维二糖合成酶 （CBS），可以尿苷二磷酸葡萄糖 （UDPG）为糖基供体合成纤 维二糖，从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R.stolonifer 中纤维二糖的胞内合成 途径，通过重叠PCR 在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp 中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA，分 别转化原菌TP-02 和△ugp 突变株，构建△ggp 和△ugp/△ggp 突变株。利用液质联用（LC-MS） 检测突变株的胞内糖组分，发现ggp 的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱，而同时缺失 1 v ugp 则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR 结果显示△ggp 突变株中纤维素酶基因转录水平 0 较原株TP-02 下调20%左右，而△ugp/△ggp 突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80% 1 左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究，发现△ugp/△ggp 突变株中几乎检测 3 0 不到纤维素酶活力。结果显示，UDPG 为R.stolonifer 胞内合成纤维二糖的主要糖基供体， 0 而GDPG 可能是UDPG 的替代物，在UDPG 不足时维持胞内二糖合成。此外，利用生物信 . 1 息学方法对CBS 结构功能深入分析，经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为 0 8 Asp210和Asp300，为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。 1 关键词 纤维二糖 纤维素酶 匍枝根霉 合成机制 0 中图分类号 Q78 2 : v i 纤维素酶是一种由内切葡聚糖酶 （EG）、外切葡聚糖酶 （CBH）和β-葡萄糖 X a 苷酶（BG）组成的复合酶，通过三者的协同作用催化纤维素及其衍生物中的β-1,4- n i [1,2] h 糖苷键的水解，因而在木质纤维素转化为糖的过程中具有重要的意义 。传统 c 纤维素碳源能诱导丝状真菌分泌纤维素酶全酶系，但存在底物利用率低，产酶速 度慢，发酵周期长等多种问题，制约大规模工业生产。目前，槐糖、纤维二糖、 [3-5] 乳糖和淀粉糖等已被相继报道具有诱导纤维素酶表达的作用 。其中，纤维二 糖是丝状真菌产纤维素酶的天然诱导因子，可有效诱导里氏木霉、黑曲霉和粗糙 [6-8] 脉孢菌等解纤维素真菌中纤维素酶基因的表达 。前期研究发现，匍枝根霉纤 [9] 维素酶合成过程中存在一个关键酶，即纤维二糖合成酶CBS 。它能以葡萄糖的 次级代谢产物尿苷二磷酸葡萄糖 （UDPG）为底物，在胞内合成纤维二糖。这一 结果揭示了匍枝根霉可在糖类碳