基因工程药物new.pptxVIP

第一节 概述; 基因工程是通过对目的基因的掺入，拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，再借助质粒，病毒或其他载体将目的基因转移到新的宿主细胞系统内进行复制和表达的新技术。基因工程是现代生物技术的主体及核心。又称DNA 重组，基因克隆等。 ;主要的人和事;;;;;;;;;发展现状;基因工程药物的特点;主要的基因工程药物;基因工程技术的优点;基因工程菌的制备;目的基因的获取;载体的制备;质粒载体;λ噬菌体载体;柯斯质粒载体;方法一：加同聚尾连接。 用3‘末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3’末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4DNA连接酶封口。 优点： 不易自身环化。 因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端，所以连接效率较高。 用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 通用性好。 ; 方法二：加人工接头连接 用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制酶切位点。;CCGAATTCG GGCTTAAGC;宿主细胞转化;热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 ;转化子的筛选和鉴定;单菌落快速电泳;序列测定;Southern印迹杂交;基因表达;1. 宿主菌的选择;原核细胞;大肠杆菌中的表达的缺点： 不存在信号肽，产品多为胞内产物； 分泌能力不足，常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理??程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性； 不存在翻译后修饰作用； 翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应； 产生的内毒素难以除去； 产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。;枯草芽孢杆菌 分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表达的应用中受到影响 ; 链霉菌 其是重要的工业微生物，近年来作为外源基因表达体系正日益受到人们的重视。其主要特点是：不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可以作为理想的受体菌。现已构建了一系列有效的载体，下游培养工艺也已经成熟。 ;酵母 研究基因表达调控的最有效的单细胞真核生物。 特点： ① 真核生物细胞，故有后翻译过程； ② 基因组小，仅为大肠杆菌的4倍； ③ 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式； ④ 基因操作与原核生物相似； ⑤ 可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分 泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。 ;丝状真菌 特点：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和 糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺 哺乳动物细胞 哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。 哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。 ;表达体系 综述;大肠杆菌表达体系的优点： 积累了充足经验，有多种载体可供应用； 操作安全，致病能力低 ； 技术操作简便，培养条件简单， 成本相对低得多，大规模发酵经济 ； 真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（sub-clone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。;2.1 载体----表达载体必须具备的条件 载体能独立地进行复制：载体本身就是一个复制子，具有复制起点，分为严紧型和松弛型，前者伴随染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者的复制不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝数可