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琼脂糖凝胶电泳技术 ［目的要求］ 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 ［实验原理］ 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分 子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于 等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架 在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷, 因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分 离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的;臭化乙 锭(ethidum bromide fEB ),在紫外光下可以检出10ng的DNA条带, 在电场中，pHO条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用 对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子，其迁移速度在不同 浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度 (t)成线性关系。 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但 是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅 度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大 于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cmo 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度 影响不明显,不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4°C与30°C之间 不发生明显改变,但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最 好在4°C条件下电泳。 嵌入染料荧光染料溟化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料 嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强, 还会使线状迁移率降低15%。 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。 在没有离子存在时(如误用蒸憎水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎 不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10x电泳缓冲液)，则电导 很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。 对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配 制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。 ［实验仪器与设备］ 1 ?恒温培养箱 2.琼脂糖凝胶电泳系统 3.高压灭菌锅 4.紫外线透射仪 ［实验材料］ 1 ?三轻甲基氨基甲烷(Tris) 2硼酸 3 .乙二胺四乙酸(EDTA) 4.；臭酚蓝 5 ?蔗糖 6.琼脂糖 9.DNA样品 ［实验步骤］ ?缓冲液的配制 5xTBE(5倍体积的TBE贮存液) 配 1000ml 5xTBE: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/l EDTA 20ml Ph8.0 凝胶加样缓冲液(6x) 溟酚蓝 0.25% 蔗糖 40% ;臭化乙锭溶液(EB) 0.5gg/ml ?制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表: 琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围 0.3% 0.6% 0.7% 0.9% 1.2% 1.5% 2.0% 3 ?胶板的制备 5-60 kb 1-20 kb 0.8-10 kb 0.5-7 kb 0.4-6 kb 0.2-4 kb 0.1-3 kb 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置 所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水 平位置上，用水平仪校正)。 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液 (lxTBE )o准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50% 容量。在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或 pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移 率。 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。 在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在 微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸 过程中是否由于蒸发而减少,必要时用缓冲液补 充。 使溶液冷却至60°Co加入漠化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存 液)到终浓度为0.5ug/ml ,充分混匀。 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底 板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加 样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破 裂后会使样品从玻璃板之间渗透。 将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。 检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。 在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟)，小心移去梳子和高 压灭菌纸带,将凝胶放入电泳槽中。 低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4°C，并在 冷库中