Illumina平台测序大学机械原理及常见测序文库构建.pptVIP

Illumina 平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介 目录 第一部分：测序测序原理与流程 简介 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 1-8 samples 1-8 samples DNA Illumina 测序流程 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace DNA 文库构建流程 片段化 DNA 末端补平 3’加A 接头连接 PCR 高质量DNA文库结构 文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头 此单链部分与 FlowCell表面上P7接 头相同 此单链部分与 FlowCell表面上P5接 头相同 Index Sequencing Primer 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 MiSeq 1-8 samples HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 测序芯片 (Flow Cell)简介 flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当 每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头) 在flow cell上进行cluster簇生成 仪器简介 单条DNA 模板 约1000条 DNA模板的 拷贝 cBot HiSeq Sequen ncceerr 35个循环的桥式PCR cBot 工作流程 DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链 模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上 第一链合成： 以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链 桥式PCR： 冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR 线性化： 将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除 阻断3’–OH： 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链 杂交测序引物 DNA模板杂交和一链合成 接头序列 5’-3’ 延伸 含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面 单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交 以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链 新合成的链 原始模板链 双链DNA变性 丢弃原始模板链 模板链被冲洗走 新合成的链留在FlowCell 上 桥式PCR扩增 单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥” 以接头为引物进行扩增 桥式PCR扩增 变性 变性双链的“桥” 得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子 第二轮桥式PCR扩增 完成桥式PCR扩增 完成28循环的桥式PCR 线性化 双链“桥”变性为单链 红色箭头为P5接头上的 切割位点 线性化 切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链 阻断 阻断3’ –OH 杂交Read 1 引物 Read1 测序引 物 将测序引物杂交到文库的接头上 Illumina 测序流程 HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq 1-8 samples 进行Read1 测序 杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序 HiSeq SBS 测序流程 HiSeq SBS 测序流程 1 2 3 Paired End Turnaround Sequencing By Synthesis，SBS测序原理 4种 Fl-NTP’s + 聚合酶 拍照，收集信号 去阻断，切除荧光基团 X 36 - 151 可逆终止化学反应 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) 准确度高 可以得到同聚物序列 合成 照相，收集信号 去阻断，切除荧 光基团 下一个碱基合成 100 Microns Clusters 已完成测序合成的片段 Blocked 3’-ends 变性掉已完成测序合成的 片段 恢复被阻断的3’ –OH Paired End Tu