溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨_黄赞良.docVIP

作为一种糖苷水解酶的溶菌酶,又称 N-乙 酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶,是一种能水解 致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟 类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液 (如淋巴液 、组织 (如肝 、肾细胞内等 [1]。主要 通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸 (NAM和 N-乙酰氨基葡糖 (NAG之间的 β-1,4糖苷键,使 细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽,导致细 胞壁破裂而使细菌溶解。溶菌酶对人体无毒副作 用,是一种安全的天然防腐剂,具有抗病毒、抗 菌、抗肿瘤之功效。可用作为药物制剂、防腐剂、 基因与细胞工程中细胞融合剂等 [2]。 作为碱性酶的溶菌酶,其来源不同,水解细 胞壁的性能也表现为较大差异 [3]。溶菌酶水解微 生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽 聚糖, 作用位点是 NAM 与 NAG 碳原子间的 β-1.4糖苷键 [4]。肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份 (骨架 ,是 NAG 与 NAM 通过 β-1,4 糖苷键交 替排列形成的多层网状结构的共聚物 [5]。肽聚糖 结构中的任何化学键断裂,都能促使细胞壁中的 肽聚糖分解,导致细菌细胞壁被破坏,从而体现 溶菌酶的溶菌特性 [6]。 近年来,根据不同原料及溶菌酶的特性,提 取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、 离子交换法、色谱法、亲和层析法等。结晶法这 一传统的方法,是由 Mayer Abraham 等提出并获 得结晶状溶菌酶 [7]。本文利用湖光岩地区的鹌鹑 蛋为提取原料,采用结晶法提取分离溶菌酶,进 而利用重结晶的方法反复精制,可提取到所需纯 度的溶菌酶晶体 [8]。 1　实验 1.1　主要仪器、试剂与材料 1.1.1 主要仪器 UV-29200 紫外可见分光光度计 ; JJ-a 数控恒 温磁力搅拌器 ; M304781 离心机 ; DSX-280B 蒸 气压力灭菌锅 ; KYC-111 摇床 ; SW-CJ-2F 超净 工作台 ; FD-1B-50 冷冻干燥机 ; 2X-15D 旋片式 真空泵 ; R201 旋转蒸发仪 ; Sorvalls Upert-21 高 速离心机 ; YP-5002 电子天平。 1.1.2 主要试剂 R-250、G-250考 马 斯 亮 蓝 ; NaH 2PO 4; Na 2HPO 4; 1mol/L NaOH; 20000 u/mg溶菌酶标准液; 3g/L牛肉膏 ; 营养肉汤 ; 10g/L胰蛋白陈 ; 微球菌 ; 5.1%的 NaCl溶液 ; HCl ; CH3COOH ; 琼脂。 1.1.3 主要材料 新鲜湖光岩鹌鹑蛋,购置于湖光岩农贸市场。 1.2　实验方法 溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨 黄赞良,谈海玉,邓彩思,张兆霞 *,李　泳 * (广东海洋大学,广东 湛江 524088 摘　要:以湖光岩鹌鹑蛋为原料,采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。探讨不同条件对溶菌 酶收率及活性的影响,确定溶菌酶最佳的分离提取条件:盐析NaCl质量分数为5.1%,pH=10.7,盐 析时间为120h,收率达到 0.378%,酶活力达到 13700 U/mg。 关键词:盐析法;溶菌酶;酶活力 中图分类号:S188　　 文献标识码:A　　 文章编号:1004-275X(201705-083-04 _________________________ 收稿日期:2017-04-25 基金项目:广东海洋大学团队项目(项目编号:C13435, 大学生创新创业项目(项目编号:CXXL2016152。 作者简介:黄赞良,广东海洋大学,制药工程专业,大学生。 *通讯作者:张兆霞,李泳,广东海洋大学教师,从事生物酶相关方面的科研工作。 1.2.1 溶菌酶的提取 1将新鲜鹌鹑蛋洗净晾干、用无菌注射器收 集鹌鹑蛋清液并搅拌均匀后,用纱布过滤去除蛋 清中的卵带备用。 2 取 一 定 量 蛋 清 液, 加 入 适 量 NaCl 后 搅 拌 均 匀, 用 1M 的 NaOH 溶 液 调 节 蛋 清 液, 使 pH=10.7左右, 投入适量溶菌酶晶种后, 放置于 4℃ 环境大约 5d,待析出溶菌酶晶体后,冷冻干燥得 干粉溶菌酶。 1.2.2 溶菌酶底物的制备 1培养基的配制 取 5g NaCl,3.0g 牛肉浸取物,10.0g 蛋白胨, 放置于 1 L 蒸馏水中溶解,加入 2%的琼脂液, 用酸碱液调节 pH 为 7.0,用三角瓶分装成斜面, 在 120℃的水蒸气条件下灭菌 20min 后备用。 2底物的制备 用 0.5mL 的无菌水振荡溶解冻干溶壁微球菌, 并将菌体接种于培养基斜面中,于 25℃培养 2 d, 备用(如果需要,可再次接种扩培 。用无菌水洗 涤菌体,5000r/min 离心 15min,收集沉淀菌体, 反复洗涤至无蛋白 (以考马斯亮蓝 R