蛋白质水解度的测定.docVIP

　　收稿日期:2000—05—10 文章编号:1003—7969(200006—0176—02 蛋白质水解度的测定 郭兴凤 (郑州粮食学院食品工程系,450052郑州市嵩山南路140号;作者:女,35岁,工程师 　　摘要:介绍了一种新的测定蛋白质水解度的方法,该方法利用待测蛋白样品的完全水解液做为 茚三酮比色的标准样品测定蛋白质的水解度,并和常用的几种测定水解度的方法进行了比较。该种方法消除了由一种氨基酸做为对照样品所带来的测定误差,是一种简单易行的测定水解度的方法。 关键词:蛋白质;水解度;测定 中图分类号:T Q64519+9　　　　文献标识码:A 　　水解度是指蛋白质分子中由于生物的或化学的 水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例。测定蛋白质水解度的方法很多,常用的方法有三氯乙酸沉淀法、三硝基苯磺酸法[1]、茚三酮比色法、甲醛滴定法[2]、pH -stat [3]法等。甲醛滴定法快速简单,但采用此法测定结果低于氨基酸理论含量[2];茚三酮比色法由于采用的是单一氨基酸做标准,而不同的氨基酸对茚三酮的呈色度不同,因此采用茚三酮比色法结果也有偏差[2];三硝基苯磺酸法测定的结果相对较准确,但由于所用的试剂不易获得且分析方法非常繁杂,通常情况下采用此种方法的还不太多;现在有许多研究采用pH -stat 法,这种方法也有误差,在工业生产中可用于监控水解终点,但在研究中则需要用其他的方法进行校正。 本文介绍一种新的测定水解度的方法,本方法采用茚三酮比色法,利用待水解原料的完全水解液作为标准,消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产物的呈色度不同对测定结果造成的误差,本方法是依据Qin -Y un Chen [4]的方法和现行的方法进行改进,使测定结果更接近真实值。1　原料和试剂111　主要仪器 751分光光度计,上海。112　试剂 11211　茚三酮显色液:2g 茚三酮加入100ml 蒸馏 水,溶解,放棕色瓶中保存,应每次使用前配制。 11212　pH8缓冲溶液:012m olNa 2HPO 49417ml 与012m olNaH 2PO 4513ml 合并,混匀。11213　其他试剂见有关参考文献。113　原料 11311　菜籽蛋白　由低温脱脂菜籽粕制备,蛋白质 含量7111%。 11312　蛋白酶Flav orzyme ,由N ov o 公司提供,活力500MG /g 。2　分析方法 211　完全水解蛋白液的制备 取菜籽蛋白100mg ,放入特制的反应瓶,加入100ml 6m ol 盐酸,拧紧瓶盖,放入130℃烘箱中水解24h ,冷却,过滤,滤液真空浓缩至015ml 左右,加蒸馏水90ml ,用1m olNaOH 中和至中性(pH6,定容至100ml 。 212　工作曲线的绘制 取完全水解液011ml ~110ml 于25ml 比色管中,蒸馏水稀释至410ml ,加pH8缓冲溶液110ml ,茚三酮溶液110ml ,混匀,沸水浴加热15min ,冷却,蒸馏水稀释至25ml 。570nm 测光密度(水作参比。另取100mg 蛋白,加水100ml ,振荡均匀后过滤,取相应体积的滤液,按上述方法测光密度值。相同体积样品的光密度之差与蛋白质量做工作曲线,取线性部分做标准曲线。213　水解液水解度的测定 取水解后灭酶的水解液1ml ,稀释至100ml ,过滤,取滤液1ml ~4ml (使测定值在工作曲线的线性 671中　国　油　脂　　　　　　　　　　　　　2000年第25卷第6期 部分,加水至4ml ,加pH8缓冲溶液110ml ,茚三酮溶液110ml ,沸水浴加热15min ,冷却,蒸馏水稀释至25ml ,570nm 测光密度(水作参比。另取相同浓度未水解蛋白溶液1ml ~4ml ,按上述方法测光密度,以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质含量,按下式计算水解度: DH (%= A 1000×W ×V 1×100 V 2 ×100 式中:A :查表得蛋白质的毫克数; W :称样重(g ; V 1:水解液的总体积(ml ; V 2:显色时所用稀释液的体积(ml 。 附表　不同的测定方法测定的水解液水解度结果 方　　法 123三氯乙酸沉淀法3912451449 15甲醛滴定法 151820172418茚三酮比色法(亮氨酸做标准151521182419茚三酮比色法(完全水解液做标准 1715 2413 2816 附图　不同方法测定的水解度3　结果和讨论 311　结果 为了验证此种方法的可行性,本研究用Fla 2v orzyme 对菜籽蛋白进行水解,用同一种水解液采用10%三氯乙酸沉淀法、甲醛滴定法[2]、茚三酮比色法[2]和本文所介绍的方法分别进行测定,结果见附图和附表。312　讨论 由结果可以看出,采用三氯乙酸沉淀法测定的结果最高,