检测相思子毒素BSA-ELISA条件的优化1-检测相思子.pdfVIP

检测相思子毒素BSA-ELISA条件的优化1 * 罗胜军 王哲 高英杰 李小兵 刘国文 谢光洪 徐慧娟 马惠海 江涛 孙广瑞 （吉林大学畜牧兽医学院吉林 长春 130062 ） 摘要: 目的 应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法(BSA-ELISA)建 立相思子毒素（Abrin）测定法,并初步应用人工污染香肠及生理盐水 样品中相思子毒素回收率的检测。方法 用兔抗相思子毒素多抗包被 酶标板,加入待测抗原,并依次加入生物素化鼠抗相思子毒素单克隆 抗体、碱性磷酸酶标记的链霉亲合素,用磷酸对硝基苯酯显色。结果 方法的线性范围为5～200ng/ml,检测下限为5ng/ml,批内变异系数为 1.76%～4.64% ,批间变异系数为5.96%～9.04%。结论 该方法简便、 快速,特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线 线性良好,适用于基础研究与临床检验。 关键词: 相思子毒素，生物素-链霉亲和素，BSA-ELISA 前言：相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(AbrusPreca- toriusL.)种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ricin)同为Ⅱ型核糖体 失活蛋白(RIP)家族成员，相思子毒素（abrin ）是从其种子中提取的 一种剧毒性高分子糖蛋白毒素, 其相对分子量约为60kDa～65kDa的糖 蛋白，分子由A、B两条多肽链通过一个二硫键连接而成 [1] ，其含量约 占种子2.8% - 3.0% ，是迄今为此所发现的毒性最强的植物毒素之一， 国家自然基金重点项目，编号 作者简介：罗胜军 在读硕士（1974- 男 汉族 安徽望江），研究方向：动物营养代谢及中 毒病，吉林省长春市西安大路 5333 号吉林大学畜牧兽医学院，邮编:130062 Tel） E-mail:luoshengjunxhj@ * 通讯作者 1 [2] 毒性是普通化学武器的几百倍 。成年人摄入的致死剂量为5.0～ 7.0μg/kg，对小鼠的毒性是蓖麻毒素的75倍，只要毫克量即可致人死 命，具备毒性高、中毒后无特殊的临床表现，诊断比较困难等生物毒 素武器的典型特征。在斯里兰卡和印度就曾被非法用于毒杀牲畜乃至 谋杀人的案例(Stirling，1924)。在2001年4月第23届国际生化及毒素 武器大会（BTWC ）中，相思子毒素再次被列入核查清单，本身就反 映了人们对相思子毒素军事价值的关注。此外，由于相思子毒素是一 种有效的蛋白质合成抑制剂，它在抗肿瘤方面的应用也引起广泛重 视，对多种肿瘤细胞及几种人癌移植物有很强的抑制作用，可能成为 一种极有前途的抗癌药物。因此，无论是从核查角度，还是为防护、 治疗应用目的，开展对相思子毒素检测技术的研究，建立一种灵敏、 快速的检测方法对于免疫毒素药代动力学研究、临床用药和相思子毒 素中毒诊断、法医鉴定及反生物恐怖都具有重要的意义。本文用生物 素-链霉亲合素酶联免疫吸附法（BSA- ELISA)测定相思子毒素,报告 如下。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 试剂 活化长臂生物素标记试剂盒（Sulfo-NHS-LC- Biotinylation Kit）、碱性磷酸酶标记的链霉亲合素(Alkaline Phosphatase Streptavidin)、底物-磷酸对硝基苯酯（PNPP）均购自美国Pierce 公司，相思子毒素标准品、兔抗相思子毒素多抗、鼠抗相思子毒素单 2 克隆抗体由本实验室提供；牛血清白蛋白、明胶、酪蛋白和卵清蛋白 购自Genview 公司；其它试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂； 实验用水为超纯水或去离子水。 1.1.2 设备 BS210S 电子天平为美国赛多利斯(Sartorius)公司产品；超纯水 仪为Millipore公司产品；HI98128型酸度计为意大利HANNA公司产品； 酶联免疫检测仪为美国Bio-Rad550型；微量加样器为Gilson公司产 品，96孔单条可拆酶标板为美国CORNING公司产品。 1．2 方法 1．2．1 生物素标记单抗: 标记抗体按试剂盒说明书进行。 1．2．2 BSA-ELISA法工作流程: