蛋白酶活力测定.pptxVIP

蛋白酶活力测定一、概述二、测定原理三、试剂四、操作手续五、计算六、注意事项一、概述1．什么是酶？2．影响酶催化反应的因素3．什么是酶的活力?4．测定意义5. 测定方法一种酶只作用一种底物： 淀粉酶：只能催化淀粉水解 → 糊精、低聚糖； 蛋白酶：只能催化蛋白质水解 → 氨基酸、肽； 生物催化剂特殊催化功能的蛋白质酶的特性:（1）作用有专一性、选择性（2）催化速度快（3）反应条件温和 （4）化学本质是蛋白质在激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用下，它的二、三结构会发生改变。而变性，失去催化能力这种现象叫做酶的失活 底物浓度pH温度时间底物浓度 V Vmax 底物浓度C C0 饱和浓度溶液pH的影响 OD pH pH最适酶的分类酸性蛋白酶 3350 pH最适=2～4； 7401pH最适=3.0中性蛋白酶 1398 pH最适=7～7.5； 166pH最适=7～8碱性蛋白酶 2709 pH最适=9～11； 209 pH最适=9.5～11温度的影响 OD T（℃） T最适3350：T最适 ：45℃-47℃ 40℃以下稳定1398：T最适 ：30℃-37℃（pH：6.0-6.5 ） T最适 ：40℃-50℃（pH：7.0-7.5 ）2709：T最适 ：45℃-55℃ 40℃以下稳定。 作用时间的影响A Q（反应物的消耗量或生成物的生成量) t0 t dQdtKdQdtvo结 论酶催化反应在反应初速度时间内最适温度最适pH饱合底物浓度在最大活力处比较蛋白酶的活力定义：在一定温度、pH条件下，1g酶粉或1ml酶液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。 表示为：单位/g或单位/ml。通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为5万单位，即：50000μg/g =0.05g酪氨酸/1g酶粉。测定意义胶原蛋白（80%-85%） 生皮蛋白质 弹性蛋白网硬蛋白间质蛋白 非胶原蛋白酶的活力会下降酶的催化能力强测定方法乙醇滴定法、甲醛滴定法等Folin-酚法，紫外分光光度法，残氮量测定法等等。Gross法、明胶粘度下降法、凝乳作用法 酸性蛋白酶活性，还可以根据胰蛋白酶原激活作用的大小来表示。 二、测定原理 福林试剂，在碱性情况下极不稳定。可被酚类化合物还原，而呈蓝色反应。由于蛋白质或水解产物中含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)也呈这个反应，因此可以利用这个原理来测定蛋白酶活性的强弱。1．酶催化反应酶催化酪蛋白酪氨酸条件白色至黄色粉沫，无臭无味，溶于稀碱、浓酸，在弱酸中沉淀，几乎不溶于水，有吸湿性，干燥时稳定，潮湿时迅速变质。条件： 底物浓度 温度pH时间选择：C0 T最适pH最适t0措施： C≥ C0 恒温水浴 缓冲溶液t= t0例子： 537 0.5%酪蛋白 40℃ 3.0 10min例子： 1398 0.5%酪蛋白 40℃ 7.5 10min例子： 2709 0.5%酪蛋白 40℃ 10 10min 2.显色反应钼蓝+钨蓝 福林试剂 + 酪氨酸OH- HO — —CH2—CH—COOH 还原性NH2蓝色物质 显色剂 Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4福林试剂→ HCL Li2SO4 Br2显色剂亮金黄色3．朗伯-比尔定律及其应用E —— 吸光度A —— 消光值OD —— 光密度 E = K·Ｃ·L = lg（I0/I） = K′· C透光率 T = I I0有色真溶液透过光强度I入射光强度I0CL朗伯-比尔定律的应用[X] → [RX] → ODOD=K·C[RX]被测组分的浓度与光密度OD成直线关系[X]OD OD= K′·C[X] 注 意:①选择λmaxλmax =680nm②OD值的范围OD=0.2～0.6OD=0.434．制作标准曲线酪氨酸浓度C OD C1OD1 C2OD2 C3OD3 ··· ··· CnODn福林—酚法测定蛋白酶活力 方法要点 配制系列浓度的酪氨酸标准溶液，在一定条件下（T、pH、t）与福林试剂显色后，测定光密度OD值。绘制标准曲线。精称酶制剂，配成适当浓度的溶液。以酪素为底物，在一定温度、pH下与上述酶液作用一定时间，用三氯醋酸终止反应,并使未水解的酪素沉淀，过滤，移取滤液，加入碳酸钠调节pH为碱性，再加入福林试剂，显色后测定光密度，与标准曲线比较，计算出被测酶制剂的活力。 三、试剂10﹪ CL3CCOOH 水溶液0.55mol/L碳酸钠溶液缓冲溶液福林试剂 显色剂 一种杂多酸磷钼酸 H3[P（Mo3O10）4]磷钨酸 H3[P（W3O10）4]福林试剂的配制Na2WO4·2H2O 100g Na