植物叶片中过氧化氢含量测定方法的改进.docVIP

植物叶片中过氧化氢含量测定方法的改进 3 刘 　 俊 1 　 吕 　 波 　 徐朗莱 (南京农业大学理学院 , 南京 210095 摘要 　 Ti (Ⅳ 2H 2O 2比色法因背景物质干扰而测得的植物叶片内 H 2O 2含量偏高 , 5%三氯乙酸抽提 , 活性炭脱 色 , Ti (Ⅳ 242(22吡啶偶氮 间苯二酚 (PAR 比色法测得的 H 2O 2含量偏低 . 萃取法有效地脱去丙酮提液中 的色素 , 且 H 2O 2的回收率在 95%以上 . 用过氧化氢酶 (CA T 处理作空白对照 , 利用 H 2O 2与 Ti (Ⅳ 2PAR 的显色反应 , 建立了一种简便 、快速 、准确的植物叶片内的 H 2O 2含量测定方法 , H 2O 2的最低检测浓度为 0125μmol ? L -1. 用该方法测得多种植物叶片中 H 2O 2的含量在 011~018μmol ? g -1. 关键词 　 H 2O 2, 植物叶片 , Ti (Ⅳ , 42(22吡啶偶氮 间苯二酚 (PAR , 萃取 学科分类号 　　　 文献报道的植物体内 H 2O 2含量的测定方法主 要有三种 :Ferguson 等 [1]用丙酮抽提 , Ti (Ⅳ 2 H 2O 2比色法 , 测得黄瓜子叶中 H 2O 2含量为 8153 ~22135mmol ? L -1; Patterson 等 [2]% 酸 (TCA 溶液抽提 , ( 4 (22 植物叶片中 21~0175mmol ? L -1; Chen 等 [3]H 2O 2含 量在 0112~0144mmol ? L -1. 虽然不同植物材料中 H 2O 2的含量可能有所不同 , 但文献报道植物材料 中 H 2O 2含量相差很大 , 我们在实验中也发现用不 同方法测定植物叶片中 H 2O 2含量差异甚大 . 然而 H 2O 2含量的准确定量在研究植物体内 H 2O 2的生 理作用及其机理时非常重要 , 这就有必要对植物叶 片中 H 2O 2含量测定方法进行改进 . 　　 本文以小麦叶片为材料 , 研究了 H 2O 2的抽提 方法 , 抽提液的脱色方法以及 H 2O 2定量测定方 法 , 建立了一种快速 、简便 、准确的植物材料中 H 2O 2含量的测定方法 — — — 丙酮抽提 , 萃取脱色 , Ti (Ⅳ 2PAR 比色法 . 1　 材料和方法 111　 植物材料 　　 扬麦 5号 (T. aestiv um l Var Yan Mai No 15 小麦叶片 , 取自温室盆栽 . H 2O 2, PAR , TiCl 4等 试剂均为分析纯 . 112　 H 2O 2的标定 　　 参照 Aebi (1974年 方法 [4]. 113　 Ti ( 2PAR [5]. 4H 2 11, Ti (Ⅳ 2PAR 比色法 , 参照 等 [1]方法 . 11412　 5%TCA抽提 , Ti (Ⅳ 2PAR 比色法 , 参 照 Patterson 等 [2]方法 . 11413　 丙酮抽提 , 萃取脱色 , Ti (Ⅳ 2PAR 比色法 . 　　 取 115g 小麦叶片 , 剪碎后加 3ml 冷丙酮匀 浆 , 4℃ 离心 (10000g ×10min , 取 1ml 上清 液 , 加 3ml 萃取剂 (CCl 4∶ CHCl 3=3∶ 1, 体积比 混 匀 , 再 加 5ml 蒸 馏 水 , 混 匀 , 离 心 (4000r/min , 1min , 上层水相为 H 2O 2待测液 . 各取 1ml 待测液 , 一份作空白 , 加入终浓度为 3U ? ml -1的过氧化氢酶 (CA T , 30℃ 保温 10min ; 另一份待测液 , 加等体积高温灭活的 CA T 酶液 . 两组分别加 1ml 012mol ? L -1, p H 718的磷酸缓冲 溶液 , 再加 1ml 012mmol ? L -1的 Ti (Ⅳ 2PAR 显色剂 , 45℃ 水浴保温 20min , 静置 1h 至室温 , 测 508nm 的吸光值 . 根据 ΔA 508值计算 H 2O 2的含 量 . 同方法做 H 2O 2的标准曲线 . 115　 活性炭对 H 2O 2吸附分析 　　 在 Patterson 方法的抽提液 、 H 2O 2标准溶液和 加有 H 2O 2标准溶液的抽提液中 , 分别加入活性炭 　 3国家自然科学基金资助项目 . 　 1 杭州华东基因技术研究所 , 杭州 310000. 　 Tel :(025 4396061, E 2mail :Liu 2J un @telekbird. com. cn 　 收稿日期 :1999210212, 修回日期 :2000205215 ? 8 4 5 ?