肿瘤生物治疗实验室常用实验方法-2007.pdfVIP

肿瘤生物治疗常用实验方法 生物治疗国家重点实验室 2007 年 10 月修改版 1 1. 大肠杆菌质粒 DNA 的提取（碱裂解法） 生物治疗国家重点实验室 李 炯 此方法适用于小量质粒 DNA 的提取提取的质粒 DNA 可直接用于酶切、连接、 PCR 扩增等常规分子生物学反应，但一般不适合转染等较高要求的实验。 1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中，约 1000rpm 离心 1 分钟，弃上清液，使细菌 沉淀尽量干燥； 2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100 µl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0 ，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，振荡或枪尖吹打重悬细菌； 3. 加入 200 µl 新配制的溶液 II (0.2 mol/L NaOH ，1 ％SDS （m/v ）) ，盖紧EP 管 口，快速颠倒离心管 5 次，以混合均匀，确保离心管的整个内表面与溶液 II 接触，不要涡旋，置于冰浴中；（此步为裂解细菌，裂解后的液体会拉出丝状） 4. 加入 150 µl 预冷溶液 III (每 100 ml 的溶液III 中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸，28.5 ml H O) ，盖紧EP 管口，反复颠倒数次，使溶液 III 在粘稠 2 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3~5 分钟； 5. 在最大转速下离心 5min ，取上清液于另一新EP 管； 6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA ，振荡混合于室温放置2 分钟，最大转 速离心 5 分钟； 7. 小心弃上清，注意勿触动沉淀，加 1ml70% 乙醇洗涤沉淀，用12,000g 离心2 分钟，弃上清 瞬时离心将附于管壁的液体吸出，将 EP 管开口置于室温 5~10min 使乙醇挥发，用适量的 ddH O 溶解。 2 8. 加入 0.5µl 的 RNase （10mg/ml ）37℃温育 5~10 分钟； 9. 电泳鉴定。 附：质粒 DNA 的快速抽提适用于快速鉴定细菌中质粒的有无、大小或含量高低 等，得到的质粒仅可用于电泳或转化，不适于其它与分子生物学反应。 1.取菌液 100~500µl ，10000g 离心 1min； 2.弃上清，加入 20~50µldd H2O 重悬菌体； 3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1 ）混匀； 4.10000g 离心3~5min； 5.小心取出上清即可用于电泳鉴定或转化。 2 2．琼脂糖核酸电泳 生物治疗国家重点实验室 文艳君 1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架 好梳子；实验室有几种不同厂家的模具和梳子，请注意配套使用； 2. 根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确 称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般 20~30 ml ）； 3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分 混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，注意不能产生气泡，若有气泡则设法排除， 静置，待其凝固； 4. 室温下 30~45 分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面 1mm 为宜，如样品孔内有气 泡，应设法除去； 6. 在 DNA 样品中加入 10×体积的载样缓冲液（loading buffer ），混匀后，用枪 将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内； 7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠 近加样孔的一端为负) 。一般 60 ～100V 电压，电泳20 ～40min 即可；