豚鼠干细胞因子肥大细胞生长因子(SCFMGF)酶联免疫.doc

豚鼠干细胞因子/肥大细胞生长因子(SCF/MGF)酶联免疫 分析试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号：CSB-E12066Gp 检测范围：15.6 pg/ml - 1000 pg/ml 最低检测限：3.9 pg/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的豚鼠SCF/MGF，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定豚鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中SCF/MGF含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 概述 干细胞因子(stem cell factor，SCF)又称肥大细胞生长因子(mast cell growth factor，MGF)，最初是从Buffalo大鼠肝细胞系中cDNA克隆成功，在小鼠MGF基因位于第10号染色体SL基因，是C-kit的配体(C-kit ligand，KL)，因此也称之造血生长因子KL。SCF主要由肝细胞产生。人和小鼠SCF分别由248和220个氨基酸组成，约有80％同源性。SCF可以可溶性和膜结合两种形式存在，可能与SCF mRNA剪接或蛋白酶切割位点不同有关。在体内SCF以非共价相连同源二聚体形式存在，单体分子量约31kDa， 单体中含有4个半胱氨酸残基，形成分子内二硫键。糖基对SCF生物学活性并非必需。SCF受体即是C-kit，成熟SCF受体分子由953个氨基酸组成,其中胞膜外区497个氨基酸，属免疫球蛋白超家族成员，组成5个Ig样的结构域，与M-CSFR、 PDGFR有较高的同源性；穿膜区由23个疏水性氨基酸组成；胞浆区433个氨基酸， 含有酪氨酸激酶和自身磷酸化的结构域。SCFR表达于多种干细胞、集落形成细胞和肥大细胞等。SCF的生物学作用有：促进IL-3依赖的早期造血前体细胞的增殖和分化；促进肥大细胞增殖；促进黑素母细胞(melanoblasts)的增殖。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗SCF/MGF抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗SCF/MGF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的SCF/MGF呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。 标准品（Standard）：2瓶(冻干品)。 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液?（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 标准规格酶标仪 高速离心机 电热恒温培养箱 干净的试管和Eppendof管 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠