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叶绿素含量的测定 基础生物学实验（三） 一、实验目的 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二、实验原理及要求 1、 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。 今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 2、了解叶绿素a和b及总量的最大吸收峰，学会分光光度计的使用方法及其原理。 三、实验材料、试剂与仪器设备 （一）材料： 新鲜的绿色植物叶片。 （二）仪器设备： 1. 分光光度计；2. 电子天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。 （三）试剂： 80％丙酮；石英砂. 四、操作步骤 1、取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。 2、称取剪碎的新鲜样品0.2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及5ml　80%丙酮，研成均浆，再加80%丙酮10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。 3、取滤纸1张，置漏斗中，用80%丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量80%丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4、用滴管吸取80%丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80%丙酮定容至25ml，摇匀。 5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以80%丙酮为空白，在波长663nm、645nm下测定吸光度。 6、结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=12.7A663－2.69A645； Cb=22.9A645－4.69A663； 据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。 五、注意事项 1、为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行；研磨时间尽可能短些，以不超过两分钟为宜。 2、过滤时必须将滤纸及叶片残渣洗至无绿色为止。比色时提取液不能混浊。 六、作业 1、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素a与叶绿素b的比值有无不同。 2、分光光度法和比色法有何异同？ 3、叶绿素a和叶绿素b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和叶绿素b的定量分析，为什么？ * 《基础生物学实验》精品课程 * 《基础生物学实验》精品课程