3 基因工程的工具酶.pptxVIP

第三章 基因工程的工具酶;第一节 基因工程的工具酶;一、限制性核酸内切酶（Endonucleosase）;2）限制性核酸内切酶的类型;（二）II类限制性内切酶的命名及特性 ;（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 ;几种最常用的限制性核酸内切酶 ;二、T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase） ;三、核酸酶 ;（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana) 单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+　　用途：　　　构建限制酶图谱　　　产生末端缺失突变　　　DNA超螺旋线性化　 （二）E. coli外切酶III　　只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。;（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌）　　特性：　　1. 降解单链DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度　　2. 降解发生的方式为内切　　3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境，Zn2+激活　　4. 酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低75000倍　;（四） DNase I: 来自于牛胰腺，既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链 （五）RNase H： 切割DNA—RNA杂交双链中的RNA序列，使杂交双链变成单链DNA结构;四、聚合酶 ;（二） Klenow酶 ;（三） T4 DNA聚合酶 ;（四）T7 DNA聚合酶　　测序酶　 （五） Taq DNA聚合酶　　耐高温，主要用于PCR反应; DNA聚合酶活性　 RNase H活性　 DNA内切酶活性　 核酸结合活性;反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链;反转录酶的基本特性： （RNase H） 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链;五、DNA修饰酶 ; 3） 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。;DNA重组技术中最常用的工具酶 ;第二节 DNA的切割反应;一、缓冲系统的组成 ;二、酶切操作 ;三、酶切结果分析 ;2） DNA分子的检测 a. 染色EB，DNA分子小于25ng，很难检测到。　b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子。 ;（二）估计DNA分子的大小　　 根据DNA分子的迁移率，可以用公式计算出分子量 D= a – b (logM) D是移动的距离，M是分子量，a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变。 也可根据已知大小的片段进行比较，误差约在5%左右。;四、多酶联合酶解 ;五、定位酶切位点 ;六、 限制性内切酶的star活性