第五章继代培养27232057-精选课件(公开).ppt

第五章 继代培养 一、细胞脱分化与愈伤组织: 培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。 脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。 愈伤组织的特征: 愈伤组织细胞大而不规则，高度液泡化、没有次生细胞壁和胞间连丝。愈伤组织从其表面向内5-10个细胞是分生中心，细胞体积明显的小，有胞间连丝和果胶质。这一分生中主是愈伤组织增殖的主要部位。 二、愈伤组织形成的条件: 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类,而是培养条件,其中激素的种类和浓度最为重要. 诱导愈伤组织常用的生长素是2,4-D,IAA 和 NAA.常用的细胞分裂素是KT和6-BA. 在禾谷类植物中，多数情况下只用2,4-D就能成功地诱导愈伤组织，但若以NAA代替2,4-D ，外植体则只会生根，而不愈伤化。 当以烟草茎髓、胡萝卜贮藏根和马铃薯块茎组织作外植体时，诱导愈伤组织则既需要生长素，也需要细胞分裂素。 三、愈伤组织形成的过程 细胞脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括： 细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。 根据愈伤组织形成过程的时空顺序，可分为三个阶段： 第一阶段为诱导期（细胞分裂的准备期）： 表现为细胞质增生，出现活跃的原生质流动，贮藏物质淀粉等消失；细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNA迅速合成和累积。 此阶段长短的决定因素：植物种类；同种植物不同生理状。如开始第一次细胞分裂所需时间：菊芋块茎未经贮藏需22h,贮藏后需40h；胡萝卜--96h. 第二阶段为分裂期（细胞从开始分裂到持续分裂的时期）： 细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡,RNA含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。 第三阶段为形成期： 外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期. 生化变化----各种酶活性加强、淀粉的累积、RNA和组蛋白合成速度加快。 形成期的特征----细胞形态大小保持相对稳定，体积不再减小，愈伤组织不再增殖。 优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个特性： A 高度的胚性或再分化能力，以便从这些 愈伤组织中得到再生植株。 B 容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优 良的悬浮系，并且在需要时能从中分离 出全能性原生质体。 C 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤 组织建立大规模的愈伤组织无性系。 D 经过长期继代保存而不丧失胚性，以便 可能对它们进行各种遗传操作。 四、 诱导愈伤组织时通常采用的策略： A 选择适当的基因型和适当的外植体。 B 选择正确的培养基，特别是正确的植物激 素的种类和浓度，以及在需要配合使用生 长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配 比。 C 采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱 导培养基和培养条件。 在玉米幼胚愈伤组织培养中，一些研究者通过在培养基中添加5mg/L或10mg/L AgNO3，抑制愈伤组织内乙烯的作用，从而使类型II愈伤组织的频率显著提高。 类型I： 结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型. 类型II： 结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快，称为亢进分裂型. 类型III： 结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡，称为衰败型. 生长素促使细胞进入亢进状态. 细胞分裂素促使细胞进入保守状态. 还原态氮（氨态氮）促进细胞分裂. 硝态氮抑制细胞分裂. 六、继代培养 1、愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程收继代。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。 2、通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保存持在不分化的增殖状态。 如果让愈伤组织留在原来的培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化。 1、种子无菌播种在简单营养培养基（通常不必附加生长调节物质）上可萌发产生无菌实生苗，可提供无菌外植体，这对难以进行表面消毒的植物组织培养意义更大（因为种子相对耐表面消毒）。 2、种子培养可将无胚乳种子（如兰花）无菌萌发成苗。 3、种子和胚轴培养可诱导胚性愈伤组织。 4、种子