从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究.docVIP

第28卷第4期2005年12月　　　　　 辽宁师范大学学报(自然科学版 Journal of Liaoning Normal University(Natural Science Edition 　　　　　 Vol.28　No.4 Dec.　2005 　　文章编号:100021735(20050420457204 从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究 逄洪波1,2,　陈永燕1,　张恒庆2,　周其兴1 (1.大连大学生物工程学院,辽宁大连　116622;2.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连　116029 摘　要:从血液中提取基因组DNA的传统方法是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙 醇沉淀.CTAB法提取基因组DNA多应用于植物和微生物,从全血中提取基因组DNA报道甚少.采用改良的CTAB 法从全血中提取基因组DNA,并以传统方法和TA KARA Blood Genome DNA Extraction K it作对照.结果表明: CTAB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到1.8~2.0,可以满足PCR扩增和限制酶切等实验的 要求. 关键词:血液;CTAB法;DNA提取;PCR分析 中图分类号:R3　　　文献标识码:A 获得基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础,寻找合适的DNA提取方法是开展大多数分子生物学实验所面临的第一个问题.从血液中提取基因组DNA的方法大都是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀.该种方法的不足之处在于程序繁琐、耗时,而且蛋白酶K也比较昂贵.C TAB裂解提取法常用于新鲜植物组织的DNA提取.近年来, CTAB法也逐步应用于动植物标本和化石DNA的提取[1].刘波等[2]用CTAB法分别对稻蝗(Oxya的干标本和酒精浸泡标本的DNA进行提取并获得了满意结果.Yang等[3]用3种方法提取了Proboscide2 an的化石和馆藏标本的DNA,也认为用C TAB法提取化石DNA的成功率最高.但是用C TAB方法从动物全血中提取基因组DNA报道甚少.本研究的目的在于寻找一种可以获得高质量,但耗费时间少、程序简单、节约药品的血液DNA提取方法. 1　材料和方法 采集新鲜的家兔全血(静脉血[4,5],加入抗凝剂柠檬酸钠(ACD[6],选用3种不同方法从全血中提取基因组DNA,并经琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收光谱和PCR扩增来检测提取的DNA的纯度和浓度[7]. 1.1　血液标本的采集 对同一只健康家兔进行耳缘静脉取血,分装成每管0.5mL,冻存于-20℃. 1.2　D NA提取 1.2.1　试剂　4×C TAB提取液(0.1M Tris2HCl(p H8.0,0.5M NaCl,0.5M ED TA,4g C TAB,1g PV P;氯仿2异戊醇(24∶1;异丙醇;抗凝剂ACD[8];磷酸盐缓冲液(PBS[8];抽提缓冲液[8];蛋白酶K; Tris饱和酚等. 1.2.2　仪器　台式冷冻离心机(Biof uge primo R15000rad/min;紫外透射分析仪(STS型,上海长明光学电子仪器厂;稳压稳流电泳仪(D YY—Ⅲ2型,北京六一仪器厂;紫外分光光度计(日本分光株式J asco公司,V—560型. 1.2.3　方法 　改良C TAB法　采用4×CTAB(DoyleDoyle,1987法并做适当的修改,具体步骤如下:在装有血液的2mL离心管中加入500μL预热的4×CTAB提取液和2μLβ2巯基乙醇,使材料完全分 收稿日期:2005207211 基金项目:国家自然科学基金资助项目作者简介:逄洪波(19802,女,辽宁盖州人,辽宁师范大学硕士研究生. 周其兴(19712,男,四川资中人,大连大学副教授,博士.E2mail:dlzhqx@163.com. 458　辽宁师范大学学报(自然科学版第28卷散在提取液中,65℃温浴约1.5h.待冷却至室温后加入等体积的氯仿2异戊醇(24∶1,上下颠倒离心管,温和混匀5min 后离心5min (1000rad/min .将上清液转管,反复抽提3次.最后一次离心10min.吸取上清液,加入70%体积的异丙醇,沉降DNA ,轻轻颠倒2~3次,可见白色絮状沉淀,室温下静置30min 以上,然后10000rad/min 离心7min ,弃上清.用200μL 70%的乙醇和无水乙醇各洗2次,每次离心2min 后弃上清,然后将离心管放在37℃烘箱中(或室温下使乙醇挥发.待总DNA 干燥后加 50μL TE 溶液和1.5μL RNase 于37℃水浴中温浴2h ,然后于-20℃(或4℃ 冰箱中保存备用.　传统方法提取DNA 　按照《分子克隆实验指南》进行[8]