HPLC实验讲义研究生上课.ppt

* * * * 水要经过两次蒸馏处理的（有机质要出去），象二次离子交换水、电渗析水都未除有机质，注射水（针剂水）设备脏，时间长堵柱，最好自己做水，不要用生产设备上的水 * * * * 指数梯度又有凸型和凹形的区别。 * * 无定形与球形的柱效相当，但球形的渗透性优于无定性 * * （1）固定波长ＵＶ吸收检测器 光源可用低压汞灯，它能够发出９０%的２５４nm波长的光，锌灯发出214nm波长的光，镉灯则为229nm和326nm，由于得到的是固定波长的单色光，故不需要滤光片，光强高，但它只能对光源发射的特征波长有吸收的物质进行检测， （2）可变波长紫外吸收检测器 它与固定波长紫外检测器的主要差别在于使用一个连续光源（如氘灯），以光栅（或棱镜）分光。光源发出的复合光（从190nm至600nm附近），光栅分光能够随意选择定的检测波长以匹配被测物质的最大吸收波长。 * 3）二极管阵列检测器（ＤＡＤ） ?? 二极管阵列检测器可以记录190nm-900nm波长吸收光谱数据，可直接贮存色谱图中每一个点的吸收光谱。光源发出的光，通过透镜把光聚焦在检测池上。从检测池出来的光，通过透镜、狭缝到全息光栅上，经光栅分光后由一排光电二极管接收并转换为电信号，贮存于计算机中。ＤＡＤ的最大优点在于利用ＵＶ光谱识别并进行纯度分析，还可以画出保留时间、波长和吸光度的三维立体空间谱图等，这是目前较先进的紫外检测器。下图是DAD检测器工作原理示意图。 * Waters is currently working on development of a ELSD for general purpose LC. The purpose of this section is to create some awareness of this technology before the launch of the Waters design ELSD. Current Manufactures of ELSD Devices Include: Alltech – ELSD 2000 Polymer Labs – PL-ELS 2000 Sedex – Models 55, 75, 75C ESA – Model 301 , 定性确证 仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质 通过加入标准物确认 通过改变色谱条件确认 光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段 其他仪器方法（如MS）确证  第三节  HPLC使用过程中 常见问题及处理方法 平常保养 -做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率 -做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命 常做的保养 —保持仪器的环境（经常清洁仪器，尤其是灰尘） —泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水和盐不长期保存在泵里） —进样器要经常清洗，避免污染物吸附或堵塞管路 —尽量进行样品前处理 —色谱柱要定期清洗，保证柱效及使用寿命 —系统中不要长期保存水和盐，长时间不用时应将仪器所有部分全部更换为70％以上的甲醇，避免细菌的滋生及盐的析出。 液相色谱常见问题 压力异常（偏高、波动） 漏液 保留时间漂移 基线问题（漂移、噪声） 峰形异常 压力 压力是液相色谱中最重要的指标，要经常关注压力的变化。 保留时间的变化经常是由于压力问题引起的。 记下仪器正常状态时，在一定条件下（流速、温度）的压力显示值。 压力高时 吸滤头 单向阀 柱塞密封圈 线路过滤器 手动进样器 检测器 堵 措施：分段检查，从后往前，一段一段检查 先把预柱断开 检测器 柱子 自动进样器（阀切换一下） 系统堵塞： 在线过滤器堵塞 缓冲盐的结晶析出—冲洗色谱柱 PURGE阀过滤芯被污染 进样器旋转密封阀被堵塞 进样针或针座被阻塞 色谱柱堵塞时： 色谱柱污染—确认可能造成堵塞的样品的性质，相应选择 合适的清洗溶剂。 柱前筛板堵塞—反冲色谱柱、更换筛板、更换色谱柱 压力低 如果压力为零： 泵头中没有液体，而是充满了气泡 单向阀完全堵死 柱塞杆折断 压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力) 如果有压力但是压力比正常时低： 漏液 压力传感器之前某些部件堵塞 （单向阀堵塞、 溶剂进口过滤芯堵塞） 漏 排液阀 压力传感器 线路过滤器 流动相 经常漏液的部件 泵：柱塞密封圈磨损、单向阀松动 色谱柱漏液 ：接头未接好或松动 手动进样器：转子密封圈磨损，定量环、废液管阻塞 检测器： 流通池窗口（垫片损坏、透镜破碎） 接头处漏液：（接头松动、接头脏、接头