基因工程常规技术应用聚合酶链式反响.pptVIP

扩增两个引物外侧的未知序列 （2）反向PCR 把线性DNA模板转变成环形分子。 template template 3’ 5’ 5’ 3’ （传统PCR只扩增两个引物之间的已知序列）。 技术关键： * 使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。 * 扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 （3）反转录PCR（RT-PCR) Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖 技术关键： 利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 * 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 基因定点突变 基因突变检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究 …… PCR的应用 * * * * /chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. * 1986年 H. A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37度 )，PCR技术才进入实用阶段。 1988年 R.K. Saiki (才木)把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGAGCTTAGTCACT5’ primer1 primer2 Sense primer vs Antisense primer Upstream primer vs Downstream primer Forward primer vs Reverse primer Primer1 vs Primer2 避免引物之间形成引物二聚体（dimer） * 避免引物与模板的非特异性配对 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CCAGACGGTCAGATGTGCCGTAGCAAATC5’ 基因A CAGTCTAC3’ GTCAGATGTGCCGTAGCAAATC5’ 基因B 3’ATGCGAT 5’GGTCTGC * ⑤引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。该温度仅作为参考值。 适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 手工计算： 一般估计： * ⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.5?mol/L。 ⑦简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 * 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。 ⑧嵌套引物（nested primers) 1 3 2 4 ⑨涉及cDNA研究的引物 跨内含子引物 * 在线免费引物设计网站 / /tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 软件 Primer5.0、 Oligo6.0 * Primer 5.0 * * * （4）模板（template) ② 模板的量： 不能太多，模板浓度过高影响PCR反应的特异性 在一定浓度范围内，PCR产率与模板浓度成正比 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高，但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶活性的物质。 * dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 （5）dNTPs 一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 * Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。 （6）Mg 2+ 的浓度 Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。 * （7）不含Mg 2+的缓冲液 提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），50mM K+ 以及其他添加剂 * PCR的过程 （1）变性（denature）