特定寡核苷酸.ppt

烈性周期 噬菌体分离和效价测定方法 （1）双层琼脂法 分别制备含琼脂1%和2%的宿主培养基，其中2%琼脂培养基倒制底层平板。取含待测噬菌体样品0.1ml和宿主菌的培养液混合，适当稀释，取0.1ml加入到已冷却的50℃左右含1%琼脂的培养基中，混匀，倒入到底层平板上，制成双层平板。然后置宿主菌适宜的温度下培养16-20h。如果有噬菌体，在上层琼脂形成清晰的噬菌斑。 （2）单层琼脂法 （3）快速测定法 将噬菌体和对数期宿主细胞悬浮液与含有0.5%-0.8%琼脂培养基混合，加到无菌载玻片上摊平凝固。培养数小时后，显微镜或解剖镜下观察噬菌斑并计数。 （4）斑点试验法 将宿主菌制成菌悬液，涂布于平板上，45℃倒置培养一段时间，至平板表面无水膜为止。将不同稀释度的待测样品用接种环点于平板上，培养数小时，看噬菌斑的形成。 微生物菌种对噬菌体产生抗性的可能机制 宿主细胞表面不能吸附噬菌体，即没有受体部分 噬菌体吸附在细胞表面后不能把它的DNA注入细胞 噬菌体DNA注入细胞后，因细胞内缺乏噬菌体繁殖所需的某种氨基酸（如色氨酸、脯氨酸等），而不能增殖 噬菌体DNA注入细胞后，为 宿主细胞的限制－修饰系统产生的限制性内切酶消化 由溶源性和多溶源性造成的免疫性（只能对同类噬菌体有免疫作用）而不能增殖 微生物菌株对噬菌体产生溶源性的可能机制 噬菌体DNA注入宿主细胞后整合到宿主细胞的染色体，从而进入原噬菌体状态，此时的宿主细胞对同种噬菌体能产生免疫性，宿主细胞成为溶源性的。 溶源性菌株的自溶，是菌株在一定生活循环中，原噬菌体因自发或诱导因子作用，抑制性蛋白丧失，原噬菌体脱离宿主细胞染色体并增殖，把宿主细胞裂解而释放温和噬菌体和烈性噬菌体。 溶源性菌种对外来的同类噬菌体虽有免疫力，但对它裂解时所释放的部分烈性噬菌体却没有免疫力，因此也象敏感菌种一样，迅速被裂解，这就是发酵过程因噬菌体感染而化稀的原因。 微生物菌种对噬菌体产生敏感性的可能机制 限制－修饰系统的缺陷 免疫功能的缺陷 抗噬菌体菌种选育的简单流程 抗噬菌体菌株筛选流程 链霉菌溶源性排除试验 噬菌斑和噬菌体繁殖 细菌溶源性排除试验 4、营养缺陷型突变株的筛选 （1）几个概念： 三类培养基： 基本培养基（MM, minimal medium）[-]： 某野生型能生长的最低成分的组合培养基。 完全培养基（CM,complete medium）[+]： 各种营养缺陷型能生长的天然或半组合培养基 补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B 相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基 三种遗传型： 野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 [A+B+], 可在[-]生长。 营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。 [A+B-]：能在[+]、[B]生长 [A-B+]：能在[+]、[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长 原养型（prototroph） 营养缺陷型经回复突变或重组，回到原来野生型的营养要求 [A+B+], 可在[-]生长 （2）筛选步骤（5步） 诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型 属于单一基因突变，电离辐射等易引起染色体巨大损伤的诱变不宜采用。常用的有亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等。亚硝基胍诱发频率高，一般可达10%以上，最常用。 ①中间培养（CM，培养过夜） 目的：克服表型延迟 表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来。 生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。 分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。 生理性延迟的原因: 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂