不同类型细胞的培养特点讲课教案.pptVIP

第六章 个别细胞和组织的培养;;第一节 正常细胞培养;一、上皮细胞类培养;(一)表皮细胞培养 1．特点： 在有胶原的底物上易生长； 把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。 降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。 向培养基中加氢化可的松(10 μg/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol) 和10 ng/m1 促表皮生长因子(EGF) 能促表皮细胞生长。;【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。 饲细胞作用： 有同化营养液的能力。 饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。;饲细胞的制备： (1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90% 汇合时制成细胞悬液，再按103 细胞/毫升重新接种培养； (2)在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml 的丝裂霉素，按2ug/105 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50 戈瑞(Gy)； (3)细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换培养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104/ml接种入新培养基中； (4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。;2．表皮细胞培养程序： (1) 取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5 ~ 1cm2小块； (2) EDTA 处理：先置入0.02％ EDTA 中室温置5 分钟。 (3) 冷消化：换入0.25% 胰蛋白酶中，置4℃过夜； (4) 分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；;(5) 温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30 ~ 60 分钟； (6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液； (7) 加培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle 液和20％小牛血清. (8)培养：接种入碟皿中，CO2 温箱培养。;注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第二次消化。 ;(二) 胃上皮细胞培养;培养???序： (1) 取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许； (2) 清洗：用含庆大霉素(400μg/m1)和两性霉素(2μg/m1 的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm大小； (3) 消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80 分钟； (4) 离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次； ;(5) 接种：末次离心后加入含有1％ ~ 2％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。 细胞接种后一般在16 小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2 ~ 3 周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。 ;(三) 肝细胞培养;2．初代消化法培养： (1) 把肝组织切成2 ~ 4 立方毫米的小块，用不合钙镁的BSS 液洗两次； (2) 移入1:1 的0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶(都用无钙镁BSS 配制) 中，4℃冷消化10 ~ 12 小时后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可)； (3) 收集细胞、BSS 液洗1 ~ 2 次、计数、接种培养； ;3．肝脏灌流法： 需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。 (1) 无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污； (2) 取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中； 消化液在肝内停留20~ 30 分后，在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；;(3) 待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好)，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。 ;(四) 内皮细胞培养;(1)取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于4℃中，但不宜超过12 小时；无菌剪取长10 ~ 15 厘米一段。 其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养； (2) 先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的脐静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；;(3) 用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1％的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，