第九章基因工程l.pptVIP

* * 第九章 基因重组与基因工程  Gene Recombination and Genetic Engineering 转基因植物获得新的性状 把大鼠生长因子转入小鼠 得到巨大型的转基因小鼠。 用噬菌体DNA构建 重组DNA分子 用质粒 构建 重组DNA分子 基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 重组DNA技术 重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆(molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： ①载体和目的基因的分离； ②载体和目的基因的切断； ③载体和目的基因的重组； ④重组DNA的转化和扩增； ⑤重组DNA的筛选和鉴定。 一、载体和目的基因的分离 为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。 （一）载体：基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。 质粒pUC19的分子结构 2．噬菌体： 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。 3．病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。 （二）目的基因： 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。 2．人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 3．从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 4．从基因文库中筛选： 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。 基因组文库的制作 5．利用PCR合成： 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 二、载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 三、载体和目的基因的重组 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。? （一）粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。 载体DNA与目的基因的连接 （二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端