第九章高压液相色谱.pptVIP

第九章 高压液相色谱;高压液相色谱 （High Performance Liquid Chromatograph 简称HPLC）又称高速或高效液相色谱;;1）吸收了普通液相层析和气相色谱的优点； 2）它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性的物质），又有气相色谱的特点（即高压、高速、高分辨率和高灵敏度）； 3）适用于很多不易挥发，难热分解物质（如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析及其制备和分离。;现代高效液相色谱法的特点：;快速蛋白液相色谱（Fast Protein Liquid Chromatograph FPLC）;按其固定相的性质可分：;LC-MS液质联用仪;高效液相色谱仪主要有： 进样系统 输液系统 分离系统 检测系统 数据处理系统;高效液相色谱;;1. 进样系统 ;2. 输液系统 ;高效液相色谱的流动相要求：;流动相贮存器和梯度仪，可改变洗脱液的极性、离子强度、pH值、或改用竞争性抑制剂或变性剂等。使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。;采用梯度洗脱，可以提高分离效果 梯度洗提脱：在分离的过程中，应用梯度洗提装置，按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例，使流动相的成分和极性产生相应的变化，从而改变样品中不同极性的组分的相对保留值，提高分离效果，加快分析速度。 ;;3. 分离系统 ;固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成。特点： 惰性（如硅胶表面的硅醇基团基本已除去） 多孔性（孔径可达1000?） 比表面积大 其表面经过机械涂渍或用化学法偶联各种基团（如磺酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物，对结构不同的物质有良好的选择性。;; 根据柱效理论（即塔板理论数N与理论塔板高度H成反比，而H与颗粒度的平方成正比）分析，基质粒度越小，塔板理论数N就越大，分辨率也越高。另外，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60℃，改善传质速度、缩短分析时间，增加层析柱的效率。 ;色谱柱 常用内壁抛光过的不锈钢制成 标准柱型：内径为4.6mm 或 3.9mm，长为15cm-30cm 的直形不锈钢柱 填充柱的方法：干法和湿法 颗粒直径大于20μm的可用干法填充 颗粒直径10μm以下的采用湿法装柱 湿法装柱每米柱效可达3万塔板; 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成 ;柱的使用和维护注意事项：色谱柱的正确使用和维护十分重要，否则会降低柱效、缩短寿命甚至损坏。 需要维护色谱柱： ① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 ② 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 ;③ 一般色谱柱不能反冲，若标明该柱可反冲，可用反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。可以在进样器前面连接一预柱，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。;⑤ 避免将组成复杂的样品直接注入柱内，需对样品进行预处理，或在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以经常更换。 ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除柱内残留的杂质。在进行清洗时，流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ml。;⑦ 保存色谱柱时，应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 ⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。;正相色谱和反相色谱;;4．检测系统 ;（1）紫外检测器;（2）示差折光检测器 ;（3）荧光检测器; 5. 数据处理系统 ;HPLC易出现的问题;（三）质量转移（Mass transfer）溶质分子在固定相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡，流动相就向前移，非平衡移动，使区带变宽。 （四）流动相的流速当流速太低时，分子扩散严重。 （五）固定相颗粒大小固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。;